右歸飲對(duì)去卵巢血管鈣化大鼠谷氨酸NMDA受體mRNA表達(dá)的影響

黎波，劉凱，何虹材，謝若琳，孫宏*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

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實(shí) 驗(yàn) 研 究

右歸飲對(duì)去卵巢血管鈣化大鼠谷氨酸NMDA受體mRNA表達(dá)的影響

黎波1，劉凱2，何虹材3，謝若琳3，孫宏2*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;3.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

目的:觀察右歸飲對(duì)去卵巢血管鈣化谷氨酸NMDA受體mRNA表達(dá)的影響。方法：40只SD雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，低劑量組，高劑量組以及辛伐他汀組，采用華法令加注射維生素D3制備血管鈣化模型，并于造模后中藥低劑量組、高劑量組分別給予右歸飲濃縮液5.35 g/(kg·d)、16.05 g/(kg·d)灌胃，辛伐他汀組給予辛伐他汀混懸水溶液5.25 mg/(kg·d)灌胃。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，共12周。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集血漿標(biāo)本測(cè)定雌二醇和血脂的情況并應(yīng)用FQ-PCR法檢測(cè)谷氨酸離子受體mRNA表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠雌二醇、甘油三酯含量及NR1、NR2a、NR2b mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，低密度脂蛋白含量明顯升高，與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥高劑量組和低劑量組可提高雌二醇、甘油三酯以及NR1、NR2a、NR2b mRNA的表達(dá)，與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組、高劑量組和辛伐他汀組的LDL含量下降，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：右歸飲可抑制去卵巢血管鈣化的形成，可能與提高雌二醇水平以及上調(diào)NR1以及NR2a、NR2b mRNA表達(dá)有關(guān)。

右歸飲;血管鈣化;去卵巢;谷氨酸離子受體

研究發(fā)現(xiàn)在血管鈣化中存在與骨形成相關(guān)蛋白，如堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白、Runx2和基質(zhì)囊泡，羥基磷灰石礦物晶體，其鈣化機(jī)理涉及鈣/磷失衡、基質(zhì)降解或修飾、細(xì)胞凋亡、抑制鈣化失衡、促軟骨形成、成骨樣細(xì)胞的分化等方面；血管鈣化作為一個(gè)類(lèi)似于骨形成的主動(dòng)、可逆轉(zhuǎn)而且可被調(diào)節(jié)的生物學(xué)過(guò)程逐漸被學(xué)者認(rèn)同[1-3]。證據(jù)表明,神經(jīng)遞質(zhì)興奮性氨基酸谷氨酸信號(hào)通路在骨重塑中發(fā)揮重要作用，N-甲基-D-天冬氨酸功能型谷氨酸受體(N-methyl-D-aspartate Receptor, NMDAR)存在于破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞中，抑制NMDAR(NR)將阻止成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的早期分化，成骨細(xì)胞NR的封閉或敲除將影響骨的發(fā)育和形成，并主導(dǎo)骨形成的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)或抑制作用[4-5]。因此，為了觀察血管鈣化過(guò)程中NR mRNA的變化以及右歸飲對(duì)其的影響，本研究建立去卵巢腎虛血管鈣化模型，觀察右歸飲對(duì)血管鈣化過(guò)程中雌激素、血脂成分以及NR1、NR2a、NR2b相關(guān)基因表達(dá)的影響，明確其風(fēng)險(xiǎn)因素的地位，以探討其保護(hù)血管的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí) SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量(225±25)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2011-0003。

1.2 試驗(yàn)藥物及制備

右歸飲：熟地黃9 g，炒山藥6 g，山茱萸3 g，枸杞6 g，炙甘草6 g，杜仲6 g，肉桂6 g，制附子9 g，取25劑的量，水煎，頭煎加10倍水，煎煮2 h，過(guò)濾，濾渣加8倍水，煎煮1 h，過(guò)濾，濾渣加6倍水，煎煮1 h。合并濾液，減壓(65℃)濃縮至800 ml，生藥濃度為1.594 g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

30%的華法令注射液：華法令(sigma，BJ121010351A，CAS號(hào)129-06-6)，稱(chēng)取6 g華法令，加生理鹽水200 ml，混勻至清澈透明，密閉4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2%戊巴比妥鈉的制備：精確稱(chēng)取2 g戊巴比妥鈉加蒸餾水100 ml溶解即可，臨用前制備。默克集團(tuán)(Merck)國(guó)內(nèi)分裝。

維生素K1注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號(hào)1301082)；維生素D3注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)121029)；辛伐他汀片(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號(hào)121010)。

辛伐他汀水溶液混懸劑的制備(濃度0.8 mg/ml)：稱(chēng)取羧甲基纖維素鈉2.5 g，另取注射用水250 ml置于500 ml燒杯中，逐漸加入羧甲基纖維素鈉粉劑，放入磁力攪拌器攪拌90 min，液體中少許絮狀物，置入超聲清洗器中打散10 min，成透明溶液；另外將辛伐他汀片20片研成粉，加入小燒杯中，加入注射用水20 ml，將此倒入羧甲基纖維素鈉溶液中，置入超聲清洗器中打散約10 min即成白色均勻的混懸液，補(bǔ)足注射用水至500 ml，密閉4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BIO-RAD)、分光光度計(jì)(Thermo)；TriPure Isolation Reagent(羅氏公司，Cat.No.11667165001)； cDNA 合成試劑盒(Cat.No.AOPR-0200)以及熒光定量試劑盒(Cat.No.AORT-0050)(廣州復(fù)能基因有限公司)。

1.4 模型制備

去卵巢血管鈣化模型：SD雌性大鼠雙側(cè)去卵巢后飼養(yǎng)1周后參考文獻(xiàn)[6]制作血管鈣化模型，兩組均給予維生素K115 mg/(kg·d)，皮下注射，持續(xù)至第6天；第3天開(kāi)始，血管鈣化模型組另給予皮下注射維生素D330×105U /(kg·d)持續(xù)至試驗(yàn)第5天和華法令注射液150 mg/kg，每12 h序1次，背部皮下注射華法令，持續(xù)至第6天，試驗(yàn)第7天造模完成。

1.5 動(dòng)物分組及處理

40只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組，模型組，中藥低劑量組、高劑量組以及辛伐他汀組,每組8只。給藥劑量參照文獻(xiàn)[7]于造模結(jié)束后給予藥物干預(yù)，共12周。其中假手術(shù)組，模型組給予相同體積生理鹽水灌胃，每天1次；低劑量組、高劑量組給予右歸飲蒸餾水提取物，按低劑量給予5.35 g/(kg·d),高劑量組16.05 g/(kg·d)灌胃;辛伐他汀組給予辛伐他汀水溶液混懸劑按照5.25 mg/(kg·d)灌胃[8]。于相關(guān)藥物干預(yù)第12周后，給予2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg)后開(kāi)胸心臟采血并獲取主動(dòng)脈到髂動(dòng)脈組織。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 血清和血漿標(biāo)本的采集

雌二醇(E2)以及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的檢測(cè)：采用非抗凝管獲得5 ml后，由我院檢測(cè)中心采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)。室溫下靜置，待有血清析出時(shí)移至離心機(jī)中以3000 r/min離心10 min，分離出血清。按照相關(guān)試劑盒要求，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中的TC、TG、LDL、HDL 濃度。

1.6.2 FQ-PCR檢測(cè)

NR2a、NR2b、NR1 mRNA的表達(dá)：嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。內(nèi)參基因GAPDH的引物序列 GAPDH F:CACGGCAAATTCAACGGCACAGT, R:TGGGGGCATCGGCAGAAGG; NR1 的引物序F:TGTGCGGGACAACAAGCTCCA, R:ATGCCGATGCCAAAGCCGGA；NR2a 的引物序列F: GCTACGGGCAGACAGAGAAG R:GTGGTTGTCATCTGGCTCAC；NR2b引物序列F: GCTACAACACCCACGAGAAGAG R: GAGAGGGTCCACGCTTTCC。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清血脂含量比較

結(jié)果：模型組TG下降明顯，LDL升高，與假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P<0.05)，高劑量組能提高TG，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)；低劑量組、高劑量組和辛伐他汀組LDL含量下降，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)；辛伐他汀組LDL含量下降，與假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠E2含量及NR mRNA表達(dá)的比較

結(jié)果：模型組E2含量下降明顯，與假手術(shù)組比較,差異明顯(P<0.05)，低劑量組、高劑量組可提高E2的含量，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)；辛伐他汀組并未提高E2含量，與模型組比較，無(wú)明顯差異，結(jié)果見(jiàn)表2。

模型組NR2a、 NR2b 以及NR1 mRNA的表達(dá)下降明顯，與假手術(shù)組比較，有顯著性差異(P<0.01)，低劑量組、高劑量組可顯著提高NR mRNA的表達(dá)，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，與假手術(shù)組，有顯著性差異(P<0.05)；一方面說(shuō)明模型大鼠NR2a、NR2b 以及NR1 mRNA表達(dá)量下降，而右歸飲中藥具有顯著上調(diào)NR2a、NR2b 以及NR1 的基因表達(dá)量并表達(dá)超過(guò)了正常水平。辛伐他汀組亦可提高模型組NR2a、NR2b以及NR1 mRNA的表達(dá)，有顯著性差異(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血清血脂含量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表2 各組大鼠雌激素及NR mRNA表達(dá)的比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

血管鈣化的調(diào)節(jié)因素涉及基質(zhì)囊泡鈣鹽晶體成核或生長(zhǎng)、細(xì)胞死亡(凋亡)或成骨樣細(xì)胞激活、分化(血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化)以及來(lái)自骨髓破骨細(xì)胞的激活，炎癥反應(yīng)、雌激素缺乏以及血脂代謝異常等均影響其進(jìn)程。正常血管表達(dá)有鈣化抑制相關(guān)物質(zhì)，任何能夠觸發(fā)血管鈣化抑制劑表達(dá)不足的因素均可觸發(fā)和促進(jìn)血管鈣化進(jìn)程[9-10]，動(dòng)脈鈣化中氧化脂質(zhì)促進(jìn)血管細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和骨礦化[11]；雌激素缺乏同時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生較大的適應(yīng)性變化，甲狀旁腺素、維生素-D、降鈣素等激素的分泌主要對(duì)骨組織的鈣磷代謝產(chǎn)生較大影響，并且觸發(fā)血管鈣化的多個(gè)啟動(dòng)因子，如去卵巢大鼠雌激素缺乏低鈣攝入導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和動(dòng)脈中層鈣化并影響骨堿性磷酸酶的活性，而高鈣攝入不影響骨堿性磷酸酶活性[12]。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間相互作用的信號(hào)通道，在雌激素缺乏血管鈣化中，RANKL通過(guò)調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和鈣化抑制因子matrix Gla protein(MGP)表達(dá)，以及骨橋蛋白(osteopontin,OPN)促進(jìn)血管鈣化的形成，并通過(guò)在受體依賴(lài)性雌激素抵消[13]。可見(jiàn)雌激素對(duì)血管鈣化具有重要的作用。本研究觀察到去卵巢血管鈣化模型大鼠雌激素含量明顯下降，并伴有血清甘油三酯下降。與假手術(shù)組比較P<0.05，差異明顯，而膽固醇和低密度脂蛋白變化無(wú)差異。說(shuō)明血脂成分在此鈣化模型中影響不大，而雌激素的下降可能充當(dāng)一定的角色。

谷氨酸信號(hào)通路中，成骨細(xì)胞代謝性受體(Metabotropic Glutamate Receptor ,mGluR)與相關(guān)磷酸酯酶C信號(hào)(PLC信號(hào)級(jí)聯(lián))[磷酸酯酶C(PLC)-胞漿鈣離子-蛋白激酶C(PKC)級(jí)聯(lián)信號(hào)]對(duì)成骨細(xì)胞生成以及成骨前體細(xì)胞分化有關(guān)[14]，mGluRs與NRs間的對(duì)話與骨組織選擇性表達(dá)NR2亞型有關(guān)，谷氨酸通過(guò)NR參與了局部骨吸收的調(diào)節(jié)[15-17]，并且通過(guò)mGluRs受體進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)[18]，另外NR活化后鈣內(nèi)流激活nNOS 信號(hào)系統(tǒng)(neural nitric oxide synthase，nNOS)，并影響破骨細(xì)胞存活及破骨細(xì)胞吸收功能。NR的功能主要是由NRl和NR2亞基構(gòu)成的四聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)，NRl是NR的基本亞基，是實(shí)現(xiàn)通道的功能所必須的，NR2起輔助NR形成多元化結(jié)構(gòu)的作用；另外NR1、NR2a和NR2b可以組成同源二聚體，并存在于雜合NR中，在谷氨酸信號(hào)通路中，NR的激活可以上調(diào)成骨祖細(xì)胞Runx-2的表達(dá)并促使其增殖和向成骨細(xì)胞分化。對(duì)于血管中谷氨酸信號(hào)的作用研究不多，證據(jù)表明大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中mGluR發(fā)揮作用。最初的工作只是表明腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞表達(dá)有mGluR的表達(dá)[19- 20]，進(jìn)一步研究不但證明腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有I型mGluR而且具有抑制損傷引起的凋亡，通過(guò)mGluR維持膜不對(duì)稱(chēng)性抑制微血栓的形成[21-23]；另外，在腦膜微血管中存在mGluR1、 mGluR2/3、 mGluR4a、mGluR5和mGluR7[24]；在小鼠原發(fā)性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有NR1的表達(dá)并通過(guò)原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)動(dòng)脈有NR2C，并調(diào)節(jié)血管的舒張功能[25]；在臨床研究中，72 h內(nèi)監(jiān)控血液中 NR2a/2b抗體能夠早期鑒別缺血性腦卒中(以及TIA發(fā)作)和腦出血[26]；而且血清中NR2a抗體水平與多個(gè)卒中危險(xiǎn)因素相關(guān)并可作為腦卒中的一個(gè)預(yù)測(cè)因子[27]，mGluR5是β-catenin核錨定和調(diào)節(jié)同型半胱氨酸導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的主要開(kāi)關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠血管組織存在NR1、NR2a、NR2b的基因表達(dá)，在血管鈣化組織中其含量明顯降低，補(bǔ)腎中藥右歸飲可以提高血管鈣化模型大鼠NR1、NR2a、NR2b的基因表達(dá)水平并同時(shí)提高血清雌二醇含量(與模型組比較差異明顯，P<0.05)，而且提高甘油三酯接近正常(與模型組比較差異明顯)，而辛伐他汀組可以提高NR1、NR2a、NR2b的基因表達(dá)水平，但其不能升高血清雌二醇，進(jìn)一步降低LDL的含量，與假手術(shù)組比較差異明顯(P<0.05)，這可能與右歸飲多重調(diào)節(jié)功能有關(guān)，而辛伐他汀只能單一降低血脂組份。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“天癸”漸絕標(biāo)志著腎虛證形成，而腎陽(yáng)虛證涉及神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫以及神經(jīng)—內(nèi)分泌—骨代謝兩大基因調(diào)控路線的紊亂[29]。女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者雌激素依據(jù)腎氣虛證、腎陰虛證、腎陽(yáng)虛證逐漸降低[30]，男性冠心病腎陽(yáng)虛證雌二醇明顯降低[31]，表明雌激素缺乏后所表現(xiàn)的骨質(zhì)疏松和冠心病等臨床證候與中醫(yī)的腎虛證密切相關(guān)。而雌激素缺乏可引起骨重建的偶聯(lián)失衡影響鈣化進(jìn)程，去卵巢大鼠可以在一定程度模擬雌激素缺乏的腎陽(yáng)虛證，文獻(xiàn)報(bào)道[29]補(bǔ)腎中藥可提高雌激素等性激素水平以及性腺雌激素受體含量[32-33]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去卵巢血管鈣化大鼠，雌激素不但下降明顯，而且補(bǔ)腎中藥右歸飲可以提高雌二醇并提高NR1、NR2a、NR2b的基因表達(dá)，提示右歸飲對(duì)于腎虛血管鈣化病變具有一定的作用，在一定程度上驗(yàn)證了腎主骨生髓的理論，與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似。眾所周知，雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致高代謝骨量丟失從而誘發(fā)骨質(zhì)疏松，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏大量并存血管鈣化的現(xiàn)象，并與冠心病相關(guān)[34]，這種現(xiàn)象尚不能用用“骨生長(zhǎng)漂移學(xué)說(shuō)”合理解釋。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，作為異位組織骨形成再現(xiàn)的血管鈣化，應(yīng)該存在一個(gè)更加精細(xì)的鈣沉積平衡紊亂的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，這也許跟有谷氨酸信號(hào)通路中NR1與NR2a/NR2b形成相關(guān)聚合體的改變有關(guān)，這有待于進(jìn)一步的原位雜交定位實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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Effect of Youguiyin on NMDA Receptors Expression of Vascular Calcification in Rats with Ovaries

LI Bo1,LIU Kai2，HE Hong-cai3,XIE Ruo-lin3,SUN Hong2*

(1.TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China; 2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China; 3.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Objective:To study the possible mechanism of Youguiyin on regulating the expression of glutamate NMDA receptors mRNA in vascular calcification in ovariectomized rats. Methods:Totally forty SD rats were randomized into a sham group,a model group,a low-dose group, a high-dose group and a simvastatin group, with 8 in each group. The artery calcification models were established by subcutaneously injecting warfarin and vitamin D3for one week; the low-dose and high-dose groups were gavaged with 5.35 g/(kg·d),16.05 g/(kg·d)concentrated solution of Youguiyin,and the simvastatin group received 5.25 mg/(kg·d)suspensions of simvastatin.The sham group and model group were given equal amount of physiological saline with totally 12 weeks.The contents of serum estradiol and lipid(including TC,TG,LDL and HDL) were detected in all groups,with the expression of glutamate NMDA receptors mRNA by FQ-PCR.Results:Compared with the sham group, the contents of estradiol and triglycerides and the expressions of NR1, NR2a,NR2b mRNA were significantly up-regulated in the model group(P<0.05),and the content of low density lipoprotein was significantly increased (P<0.05);compared with the model group, the contents of estradiol，triglyceride levels were significantly increased and the expressions of NR1, NR2a,NR2b mRNA were significantly up-regulated in the high dose group and low dose group(P<0.01).The content of LDL was significantly decreased in the high dose group and low dose group and simvastatin group.Conclusion:Youguiyin may protect the arteries by inhibiting the formation of artery calcification.Its mechanism may be relevant to enhancing estrogen levels and up-regulating the expressions of NR1,NR2a,NR2b mRNA in vascular calcification in ovariectomized rats.

Youguiyin;Vascular calcification;Ovariectomy;Ionotropic glutamate receptor

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20114BAB205082)

黎波(1972-),男,副教授,副主任中醫(yī)師,博士,主要從事中醫(yī)藥防治動(dòng)脈硬化研究工作。

孫宏*(1982-),女, 主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病研究工作。

2015-12-11

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0034-05

修回日期：2015-12-30