富硒姬松茸對小鼠急性酒精性肝炎的保護作用及其機制

劉貴軍，李全，于雷

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

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富硒姬松茸對小鼠急性酒精性肝炎的保護作用及其機制

劉貴軍1，李全1，于雷2*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：探討富硒姬松茸對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制。方法：雌性昆明種小鼠50只，隨機分為空白對照組、急性酒精性肝損傷模型組、亞硒酸鈉組、姬松茸組和富硒姬松茸組共5個組，每組10只。除空白對照組外，其余各組均用多次灌胃50%酒精的方法建立小鼠急性酒精性肝炎模型。造模同時分別用亞硒酸鈉、姬松茸、富硒姬松茸進行干預，空白對照組和模型組每次灌服等量的純凈水。測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、環氧合酶-2(COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的含量，測定肝組織中白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量與核因子κB(NF-κB)的活性，測定肝總抗氧化能力(T-AOC)。結果：富硒姬松茸能夠明顯減少飲酒后血清中ALT、AST、COX-2、iNOS、ICAM-1和MDA的含量及肝組織中IL-1β、TNF-α的含量，降低NF-κB的活性，提高肝總抗氧化能力(P<0.05)。結論：富硒姬松茸對小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護作用，作用機制可能與抑制TNF-α、IL-1β、ICAM-1、iNOS、COX-2、NF-κB等炎性因子有關。

姬松茸；硒；酒精性肝炎

修回日期：2015-09-10

酒精性肝炎是由于攝入過量酒精導致的肝臟疾病，嚴重酗酒時可造成肝細胞大量壞死，甚至誘發肝衰竭，嚴重危害身體健康[1]。目前普遍認為炎癥是酒精性肝細胞損傷的罪魁禍首，疾病早期即可出現門靜脈周圍的炎癥細胞浸潤及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子的超表達[2]。因此，研發以控制肝臟炎癥為目標的治療藥物是治療酒精性肝炎的有效手段。

硒(Se)是人體的一種微量營養元素，作為谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的輔因子，能促進體內過氧化物的分解，增強機體的抗氧化能力。研究表明，硒可以提高機體抗氧化防御的能力[3-4]。但是，攝入過量的硒會引起中毒，安全攝入硒的最大上限是400 mg/d[5]，由于硒的安全劑量和中毒劑量差別不大，如果要長期使用硒元素，必須解決硒的最佳濃度問題。富硒姬松茸是一種新合成的硒化合物，低劑量的微量元素與食用菌結合，可以有效降低硒毒性，同時保證其生物學功能[6]。

姬松茸屬于擔子菌類，原產于巴西，在日本和中國民間被廣泛用于功能食品領域，常用以預防癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥、糖尿病和皮炎等疾病，但是，尚缺乏動物實驗和臨床隨機對照研究來驗證其治療效果[7-8]。本實驗將富硒姬松茸作用于急性酒精性肝炎模型小鼠，旨在觀察其對模型小鼠肝損傷的影響，并初步探討富硒姬松茸在急性酒精性肝炎中的作用機制，以期為酒精肝的治療提供具有良好應用前景的藥物。

1 材料

1.1 制備亞硒酸鈉溶液

將亞硒酸鈉溶于0.9%的生理鹽水中，每個安瓿瓶中滴入0.4 mL的亞硒酸鈉溶液，置于微波爐中殺菌3 min。

1.2 制備姬松茸和富硒姬松茸

姬松茸子實體購自哈爾濱同仁堂。經鑒定無誤，實驗用其水溶性提取液2 g/ml。將0.4 mg的亞硒酸鈉加入上述提取液中制備富硒姬松茸[9]。

1.3 實驗動物

雌性昆明系小鼠50只，體質量20～22 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。將小鼠置于室溫及正常明-暗周期中，給予標準的實驗室食物和充足的淡水。

2 方法

2.1 小鼠急性酒精性肝損傷模型的建立

將50只9周齡的小鼠隨機分組，設為空白對照組、急性酒精性肝損傷模型組、亞硒酸鈉組、姬松茸組和富硒姬松茸組共5個組，每組10只。除空白對照組外，連續用50%酒精給小鼠灌胃3次，間隔12 h，單次給予5 g/kg，建立小鼠急性酒精性肝炎模型；空白對照組灌胃等熱量的麥芽糖溶液。造模同時將亞硒酸鈉、姬松茸、富硒姬松茸分別給小鼠灌胃，每天1次，空白對照組和模型組每天灌服等量的純凈水。小鼠最后一次給藥4 h后，經眶靜脈叢取血，離心分離血清，20℃冰箱中保存；開胸取肝臟，4℃下冰浴在生理鹽水中。

2.2 生化指標的測定

采用ELISA法檢測谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)的水平，試劑盒購自美國西格瑪奧德里奇生物公司。

2.3 血清丙二醛含量的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛(MDA)的含量，樣本總蛋白質含量用考馬斯藍試劑分析，試劑盒及試劑均購自南京建成生物研究所。

2.4 血清COX-2、iNOS、ICAM-1含量的測定

采用ELISA法檢測血清環氧合酶-2(COX-2)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的含量，試劑盒購自恒大百盛生物(北京)科技發展有限公司。

2.5 肝組織中IL-1β、TNF-α含量和NF-κB活性測定

將肝臟樣本在5倍容積的Ripa緩沖液中解體，冰上孵育30 min，4℃下20000 g高速離心15 min，重復2次，取上清液待測。采用免疫組織化學法檢測白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，試劑盒購自上海勁馬生物技術股份公司；采用免疫組織化學法檢測核因子κB(NF-κB)的活性，試劑盒購自上海宇博科技有限公司。

2.6 肝總抗氧化能力的測定

按照上述方法制備肝組織的上清液待測。采用ELISA法檢測肝總抗氧化能力(T-AOC)，試劑盒購自上海迅達生物技術公司。

3 統計學分析

統計學處理采用SPSS19.0軟件，實驗數據用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，均值比較采用鄧肯氏新復極差法，P<0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 富硒姬松茸對模型小鼠血清ALT、AST的影響

如圖1所示，與空白對照組相比，模型組ALT、AST水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組ALT、AST水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 富硒姬松茸對急性酒精性肝損傷小鼠外周血ALT、AST水平的影響±s)注：模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4.2 富硒姬松茸對模型小鼠血清MDA含量的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，模型組MDA含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組MDA含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 富硒姬松茸對急性酒精性肝損傷小鼠外周血MDA含量的影響±s)注：模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖3 富硒姬松茸對急性酒精性肝損傷小鼠COX-2、iNOS、ICAM-1含量的影響±s)注：模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4.3 富硒姬松茸對模型小鼠血清COX-2、iNOS、ICAM-1的影響

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組COX-2、iNOS、ICAM-1水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組iNOS、ICAM-1水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，富硒姬松茸組COX-2水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)[2]。

4.4 富硒姬松茸對模型小鼠肝組織TNF-α、IL-1β含量和NF-κB活性的影響

如圖4a所示，與空白對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β含量均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組TNF-α、IL-1β含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。如圖4b所示，與空白對照組相比，模型組NF-κB活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組NF-κB活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 富硒姬松茸對急性酒精性肝損傷小肝組織TNF-α、IL-1β含量及NF-κB活性的影響±s)注：模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖5 富硒姬松茸對急性酒精性肝損傷小肝總抗氧化能力的影響±s)注：模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4.5 富硒姬松茸對模型小鼠肝總抗氧化能力的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，模型組肝總抗氧化能力顯著增強，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，富硒姬松茸組肝總抗氧化能力減弱，差異有統計學意義(P<0.05)。

5 討論

5.1 富硒姬松茸對模型小鼠肝功能的影響

酒精進入機體后主要在肝臟代謝，過量攝入會導致肝細胞凋亡和壞死，標志之一就是血漿中細胞內酶的增多[10]。ALT和AST是最重要的細胞內酶之一，能敏感地體現肝實質細胞的損傷程度。因此，密切監測血漿中ALT和AST水平，是評估肝臟功能的重要手段[11-12]。本實驗的結果表明，與空白對照組比較，模型組血清ALT和AST水平均明顯升高，這與其他文獻報道一致，也說明模型小鼠肝功能受損，模型建造較成功。與模型組比較，富硒姬松茸組ALT、AST水平均顯著降低，說明富硒姬松茸對小鼠的急性酒精性肝損傷有保護作用。

5.2 富硒姬松茸在模型小鼠急性酒精性肝炎中的作用機制

大量動物實驗和臨床研究均表明，內毒素和氧化應激是酒精性肝炎的重要致病原因[13]。酒精代謝產物能夠損害腸粘膜的通透性，產生大量的腸源性內毒素，激活肝枯否細胞釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子，直接引起肝竇內皮細胞壞死和凋亡。此外，內毒素、TNF-α還可以激活NF-κB基因途徑，介導NF-κB進入細胞核中，啟動TNF-α、IFN-γ、IL-1β、iNOS、ICAM-1等炎性因子的轉錄，從而誘導肝細胞的凋亡和壞死，趨化多形核細胞和淋巴細胞的浸潤，加重肝臟損傷[14]。

TNF-α既是NF-κB的激活劑，又是NF-κB的基因產物，這種正反饋效應無疑放大了炎癥級聯反應，導致肝損傷進一步加重。Khoruts等早在1991年就證實了血清TNF-α含量與酒精性肝損傷的程度正相關[15]。IL-1β是強效致炎因子，可以通過活化T細胞發揮抗炎作用，其水平與機體急性時相反應、ALT/AST等生化指標關系密切[16-17]。iNOS作為誘導酶主要參與一氧化氮(NO)的合成，在生理情況下幾乎不表達，但可被內毒素、TNF-α等炎癥因子誘導激活，通過NF-κB-iNOS-NO途徑生成大量NO，進而誘發強烈的脂質過氧化反應，導致肝組織損傷[18]。COX-2在生理狀態下表達于大鼠的腦、腎、脊髓及人的前列腺、肺組織中，在外周血中幾乎檢測不到，一旦機體受到損傷，在炎癥因子的刺激下被大量合成，參與疾病的病理生理過程[19]。酒精及其代謝產物可以刺激COX-2的合成，COX-2主要作為前列腺素-2的關鍵合成酶參與炎癥反應，其水平與肝臟炎癥程度密切相關[20]。ICAM-1是一種細胞黏附分子。ICAM-1在NF-κB、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的誘導下被激活，與配體淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)結合生成復合物，能夠介導T細胞、B細胞、巨噬細胞對肝臟的炎癥反應[20]。

氧化應激是指體內氧化和抗氧化狀態失衡導致的機體損傷狀態。酒精在肝臟代謝的過程中能夠產生大量的活性氧(ROS)，從而誘發脂質過氧化反應，激活肝枯否細胞及一系列炎癥因子的表達，啟動炎癥級聯反應，引發肝臟損傷[13,21]。MDA是過氧化脂質的重要代謝產物，在氧化損傷的動物模型中，可以較為特異的反應脂質過氧化的程度[22-23]。同時，伴隨著機體氧化應激的增強，體內谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化劑減少，抗氧化防御能力也會下降。由于不同的抗氧化劑之間存在相互作用，加之單一測定某種抗氧化劑的抗氧化能力難度較大，實踐中通常采用T-AOC對相對總抗氧化能力進行評價，判斷肝臟抗氧化的能力[24-25]。

本實驗的結果表明，富硒姬松茸組的ALT、AST水平顯著低于模型組，說明富硒姬松茸可以有效控制酒精引起的肝臟炎癥。富硒姬松茸組的MDA含量顯著低于模型組，肝總抗氧化能力亦增強，均提示富硒姬松茸能夠減輕機體的脂質過氧化損傷，提高抗氧化防御能力，這可能是其發揮抗炎作用的機制之一。此外，富硒姬松茸還能抑制炎癥因子ICAM-1、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β的表達，這可能與富硒姬松茸阻斷NF-κB相關的基因途徑有關，由此推斷，富硒姬松茸可以通過調節體內炎癥因子的失衡發揮抗炎作用。但是，與模型組比較，亞硒酸鈉組和姬松茸組的上述指標均無明顯變化，說明亞硒酸鈉和姬松茸的抗炎作用較弱，只有姬松茸和亞硒酸鈉相結合才可以對小鼠的酒精性肝損傷起到保護作用。

[1] 鄒正升,李保森,常彬霞,等.對酒精性肝炎臨床診斷標準的再認識[J].傳染病信息,2013,26(5):259-262.

[2] Bataller R, Brenner DA. Liver fibrosis[J]. J Clin Invest,2005,115:209-218.

[3] Hoffman DJ.Role of selenium toxicity and oxidative stress inaquatic birds[J].Aquat Toxicol,2002,57:11-26.

[4] 潘麗元，陳國靜，楊潔茹，等.富硒香菇多糖的藥理活性研究[J].中醫藥信息,2000,17(6):51-52.

[5] Zhang J, Wang X, Xu T. Elemental selenium at nano size(Nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with se-methylselenocysteine in mice[J].Toxicol Sci,2008,101:22-31.

[6] Han C,Li J,Hui Q.Determination of trace elements in Jinqi, a traditional Chinese medicine[J].Biol Trace Elem Res,2008,122:122-126.

[7] Hsu CH, Liao YL, Lin SC,et al.The mushroom Agaricus brasiliensis in combination with metformin and gliclazide improves insulin resistance in type 2 diabetes: a randomized, double-blind and placebo-controlled clinical trial[J].J Altern Complement Med,2007,13:97-102.

[8] 崔立然，王桂梅，孫立冬，等.低分子量姬松茸多糖的免疫活性研究[J].中醫藥信息,2013,30(2):10-13.

[9] Zhang J, Wang X, Xu T.Elemental selenium at nano size(Nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with se-methylselenocysteine in mice[J].Toxicol Sci,2008,101:22-31.

[10] Baldi E, Burra P, Plebani M, et al.Serum malondialdehyde and mitochondrial aspartate aminotransferase activity asmarkers of chronic alcohol intake and alcoholic liver disease[J].Ital J Gastroenterol,1993,25:429-432.

[11] Agarwal M, Srivastava VK, Saxena KK, et al. Hepatoprotective activity of beta vulgaris against CCl4-induced hepatic injury in rats[J].Fitoterapia,2006,77:91-93.

[12] 楊琳，梁雪琰，趙洪海，等.護肝片降低CCL4肝損傷模型大鼠丙氨酸氨基轉移酶作用及其機制[J].中醫藥信息,2014,31(3):114-117.

[13] 王洪巖,李鑫,徐有青.酒精性肝病發病機制研究進展[J].實用肝臟病雜志,2014,17(1):5-8.

[14] Mandrekar P, Bala S, Catalano D, et al. The opposite effects of acute and chronic alcohol on lipopolysaccharideinduced inflammation are linked to IRAK-M in human monocytes[J].J Immunol,2009,183:1320-1327.

[15] Khoruts, A, Stahnke L, Mcclain CJ, et al. Circulating tumor necrosis factor, interleukin-1 and interleukin-6 concentrations in chronic alcoholic patients[J].Hepatology,1991,13(2):267-276.

[16] 陳天波，劉濤，王政強，等.慢性前列腺炎中醫證型與IL-1β、TNF-α的相關性研究[J].中醫藥信息,2015,32(3):75-78.

[17] Jun Xu, Xiao Liu, Bin Gao,et al. New approaches for studying alcoholic liver disease[J].Current Pathobiology Reports,2014,2(4):1-13.

[18] Chen, Boting. The structure and function of nf-κb and its relation with alcoholic liver disease[J].Chinese Journal of Gastroenterology and Hepatology,2009,18(1):78-82.

[19] 陳君,羅永煌.環氧合酶及其抑制劑的研究進展[J].中國動物保健,2011,13(4):15-18.

[20] Zingarelli B, Sheehan M,Wong HR.Nuclear factor-kappaB as a therapeutic target in critical caremedicine[J].Crit CareMed,2003,31(1):105-111.

[21] 栗明,曹彬彬,苑海剛.烏芪通絡膠囊對實驗性大鼠坐骨神經VEGF及ROS影響的實驗研究[J].中醫藥信息,2014,31(6):101-104.

[22] 斯琴,布日額.苦瓜提取物影響Ⅱ型糖尿病小鼠血清SOD、MDA的Meta分析[J].中醫藥信息，2015，32(1)：17-20.

[23] 康天濟，韓宇博，田苗，等.芩桂術甘湯對心肌缺血再灌注損傷SOD、MDA含量的影響[J].中醫藥信息，2014，31(3)：53-55.

[24] 邱萍,李相,孔德松,等.酒精性肝病發病機制研究的新進展[J].中國藥理學通報,2014,30(2):160-163.

[25] 翁康生,王文靜,仲偉鑒.抗氧化能力指數測定法的研究與應用進展[J].環境與職業醫學,2013,30(2):150-153.

Protective Effect of Selenium-enriched Agaricus Blazei Murill onAcute Alcoholic Hepatitis in Mice and Its Mechanism

LIU Gui-jun1，LI Quan1，YU Lei2*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFourthHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective: To study the protective effect of Selenium-enriched Agaricus blazei Murill (Se-AbM) on alcohol-induced liver injured mice and its mechanism, in order to provide an aussichtsreich drug for alcoholic hepatitis. Methods: Fifty female Kunming mice were allocated randomly into five groups: blank control, moldel of acute alcoholic hepatitis, sodium selenite (SS), agaricus blazei murill (ABM), and Se-AbM, with 10 mice in each group. The blank control group received no treatment and others were fed intragastrically with 50% ethanol repeatedly for making rat models with acute alcohol liver hepatitis. SS, AbM, and Se-AbM were gavaged simultaneously with ethanol treatment, when the blank control and the model group received a comparable amount of water solution every time. Subsequent serum alanine aminotransferase (ALT) level, aspartate aminotransaminase (AST) level, maleic dialdehyde (MDA) level, inducible nitric oxide synthase (iNOS) level, intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) level, cyclooxygenase-2 (COX-2) level, hepatic tumor necrosis factor-α (TNF-α) level, interleukin-1β (IL-1β), nuclear factor kappa B (NF-κB) level, and hepatic total antioxidant status (TAOS) were determined. Results: Se-AbM administration markedly decreased serum ALT, AST, ICAM-1, COX-2, iNOS and MDA levels, hepatic IL-1β, TNF-α and NF-κB levels, and improved the liver total antioxidant capacity compared with alcohol administration(P<0.05). Conclusion: Se-AbM has a significantly protective effect on ethanol-induced liver injured mice,and the mechanism is related to the inhibition of inflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-1β,ICAM-1, iNOS, COX-2, NF-κB etc.

Agaricus blazei Murill;Selenium;Alcoholic hepatitis

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0015-05

劉貴軍(1979-)，男，助理研究員，醫學博士，主要研究方向：方劑配伍規律研究。

于雷*(1977-)，男，研究員，醫學博士，碩士研究生導師，主要研究方向：傳染病的診斷與治療。

2015-08-25