淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的制備與表征

孟繁興，李妍，盧芳，劉樹民*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國科學院大連化學物理研究所藥用資源開發(fā)組，遼寧 大連 116023)

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淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的制備與表征

孟繁興1，李妍2，盧芳1，劉樹民1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國科學院大連化學物理研究所藥用資源開發(fā)組，遼寧 大連 116023)

目的：鑒定淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，并進行制備與結(jié)構(gòu)表征。方法：應(yīng)用人肝微粒體孵育體系對淫羊藿次苷II葡糖醛酸結(jié)合代謝途徑進行鑒定，并應(yīng)用重組UGT1A1高效制備葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，最后經(jīng)NMR對該產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行表征。結(jié)果：淫羊藿次苷II在人肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物為淫羊藿次苷II-7-O-葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。結(jié)論：采用體外孵育方法可以高效特異地制備淫羊藿次苷II的葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。

淫羊藿次苷Ⅱ；人肝微粒體；葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物；核磁共振

具有8位異戊烯基的黃酮及其衍生物是淫羊藿化學成分的重要組成部分[1-3]。淫羊藿苷被認為是淫羊藿最為主要的黃酮苷類化合物之一[4-7]，與朝藿定A、B、C均可在腸道菌的作用下轉(zhuǎn)化為淫羊藿次苷II，進而被吸收入血后發(fā)揮藥效作用[8]。體外藥理實驗結(jié)果顯示，淫羊藿次苷Ⅱ具有抗腫瘤[9]、抗衰老[10-11]、抗骨質(zhì)酥松[12-13]及抗陰莖勃起功能障礙[14]等多種藥理活性。但是，淫羊藿次苷II經(jīng)口服吸收后受首過效應(yīng)影響顯著，大鼠體內(nèi)的生物利用度僅為4.1%[15]，葡萄糖醛酸化反應(yīng)是其在大鼠體內(nèi)最為重要的生物轉(zhuǎn)化途徑。但對淫羊藿次苷II在人體內(nèi)的代謝情況研究較少，本研究采用體外孵育方法鑒定淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，并對該代謝產(chǎn)物進行高效特異地制備及結(jié)構(gòu)表征。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑

淫羊藿次苷Ⅱ(批號150627，純度98.0%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，批號069K7017V，美國Sigma-Aldrich公司)；聚乙二醇十六烷基醚(Brij 58，批號055K0045，美國Sigma-Aldrich公司)；氯化鎂(批號20100110，天津市科密歐化學試劑有限公司)；Tris堿(批號527K073，北京索萊寶科技有限公司)；甲酸(色譜純，批號A0326132，美國Acros organics公司)；鹽酸(分析純，批號20150818，天津市科密歐化學試劑有限公司)；人肝微粒體(批號LPS，上海瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；二甲基亞砜(批號14010920，美國TEDIA公司)；去離子水(自制)。

1.2 儀器

UFLC色譜儀，LC-30AD高壓泵，SPD-20A紫外/可見光檢測器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，DGU-20A真空在線脫氣機，SIL-30AC自動進樣器，CTO-30A柱溫箱，LabSolutions 5.81數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(日本SHIMADZU公司)；超導(dǎo)核磁共振儀(Avance III 400 MHz，瑞士Brucker 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；渦旋振蕩器(LAB DANCER S25，德國IKA公司)；低溫高速離心機(HERAEUS X1R，美國Thermo Scientific公司)；恒溫混勻儀(Thermo-Shaker MS-100，美國Thermo Scientific公司)；分析天平(BSA224S，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；超純水制備系統(tǒng)(Milli-Q，美國MILLIPORE公司)；制冰機(IMS-20，江蘇省常熟市雪科電器有限公司)。

2 方法

2.1 分析條件

色譜柱：VP-ODS C18色譜柱(5 μm，150.0 mm×2.1 mm)；柱溫：40 ℃；流動相：A(乙腈) 和 B(0.2%甲酸水)，流速0.4 mL/min，梯度洗脫程序：0～7.0 min，90% B～10% B；7.0～8.0 min，10% B；8.0～9.0 min，10% B～90% B；9.0～12.0 min，90% B。檢測波長：270 nm；進樣量：5 μL。

2.2 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸結(jié)合代謝途徑的鑒定

100 μM淫羊藿次苷Ⅱ，50 mM Tris-HCl緩沖液(pH值7.4)，5 mM MgCl2， 2 mM UDPGA，1 mg/mL Brij 58，0.5 mg/mL人肝微粒體蛋白，每個樣本體積為200 μL，雙樣本。37 ℃預(yù)孵育3 min，加入UDPGA啟動反應(yīng)，孵育60 min后加入200 μL冰乙腈終止反應(yīng)，立即渦旋混勻，14000 rpm，4 ℃離心20 min，取上清液置UFLC檢測。

2.3 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物制備與表征

采用500 μM的淫羊藿次苷II與蛋白濃度為0.5 mg/mL的人重組酶UGT1A1進行代謝產(chǎn)物制備，37 ℃孵育24 h，加入等體積乙腈終止反應(yīng)，離心移取上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，采用減壓蒸發(fā)除去有機溶劑。殘留液通過SPE固相萃取柱(C18WAX，北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)進行富集和選擇性洗脫。富集前依次使用甲醇和蒸餾水活化，上樣同時檢測上樣流出液，上樣后依次用6 mL水，12 mL甲醇和12 mL含5%甲酸的甲醇進行洗脫，洗脫液采用UFLC進行目標產(chǎn)物監(jiān)測。所得產(chǎn)物經(jīng)氘代DMSO溶解后采用1H-NMR、13C-NMR方法進行結(jié)構(gòu)表征。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸結(jié)合代謝途徑的鑒定

淫羊藿次苷II在人肝微粒體反應(yīng)體系中出現(xiàn)一個保留時間為4.6 min的色譜峰，見圖1。該色譜峰在不加UDPGA對照組中沒有出現(xiàn)。經(jīng)推測，該色譜峰為淫羊藿次苷Ⅱ-7-O-葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。

Figure 1 UFLC chromatograms of icariside Ⅱ and its glucuronide in human liver microsomes

3.2 淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

淫羊藿次苷Ⅱ與其葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物核磁結(jié)構(gòu)表征結(jié)果見表1。經(jīng)鑒定，并與文獻對照[16]，該代謝產(chǎn)物為7-O-葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

Table.1 1H and 13C NMR data for icarisideⅡ and its glucuronide

4 討論

葡萄糖醛酸化反應(yīng)是由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的代謝反應(yīng)，肝臟是最為重要的葡萄糖醛酸化反應(yīng)器官，運用肝微粒體可以進行藥物體外代謝途徑研究，還可以預(yù)測藥物在體內(nèi)的清除速率[17]。體外代謝酶歸屬研究中發(fā)現(xiàn)，UGT1A1是肝臟中參與淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝的主要UGT酶，所以采用實驗室重組表達的UGT1A1高效轉(zhuǎn)化淫羊藿次苷Ⅱ，在37 ℃條件下孵育24 h后底物轉(zhuǎn)化率可達81%。在產(chǎn)物制備過程中，未轉(zhuǎn)化的淫羊藿次苷II可以被甲醇溶液選擇性洗脫，代謝產(chǎn)物可以被5%甲酸甲醇溶液選擇性洗脫，同樣達到了高效特異制備淫羊藿次苷II葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物的目的。

[1] Ma H,He X,Yang Y,et al.The genus Epimedium: an ethnopharmacological and phytochemical review[J].Journal of ethnopharmacology,2011,134(3):519-541.

[2] 趙文靜,王歷,王芝蘭,等.淫羊藿的藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(2):105-108.

[3] 薛迪,楊曉旭,王宇,等.基于性激素樣作用的淫羊藿有效組分篩選研究[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(5):13-17.

[4] 尹志峰,劉敬閃,張?zhí)m桐.淫羊藿苷的含量測定方法[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2003,23(8):493-495.

[5] 訾慧,盧健,張紅梅,等.淫羊藿提取物中淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物在骨質(zhì)疏松模型大鼠腎臟中的分布研究[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(5):60-63.

[6] 郭寶林,肖培根.5種淫羊藿的不同部位的黃酮類成分分析[J].中國中藥雜志,1996,21(9):523-525.

[7] 朱瑞清，李志忠，周建，等.淫羊藿苷及其擬代謝物的雌激素樣作用研究[J].中醫(yī)藥學報，2012,40(3):15-20.

[8] 韓惠,單淇,周福軍,等.淫羊藿中活性成分的代謝產(chǎn)物研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2013,28(1):78-81.

[9] Li H.Icariside Ⅱ prevents high-glucose-induced injury on human cavernous endothelial cells through Akt-eNOS signaling pathway[J].Andrology,2015,3(2):408-416.

[10] Zhang D.Herba epimedii flavonoids suppress osteoclastic differentiation and bone resorption by inducing G2/M arrest and apoptosis[J].Biochimie,2012,94(12):2514-2522.

[11] 張玉昆，牛雯穎，姜廣坤,等.淫羊藿對雌性大鼠雙側(cè)卵巢摘除模型的影響[J].中醫(yī)藥學報，2016,44(3):24-26.

[12] 翟遠坤,葛寶豐,陳克明,等.淫羊藿苷與其代謝產(chǎn)物淫羊藿次苷Ⅱ?qū)撬栝g充質(zhì)干細胞成骨性分化影響的比較研究[J].中藥材,2010,33(12):1896-1900.

[13] 姚暄，賈立群，譚煌英,等.補腎壯骨中藥對大鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型骨痛及骨質(zhì)破壞的影響[J].中醫(yī)藥學報，2012,40(2):14-16.

[14] 周欣,翟所迪.選擇性磷酸二酯酶5抑制劑治療陰莖勃起功能障礙的臨床評價[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2009,9(6):408-410.

[15] Cheng T,Zhang Y,Zhang T,et al.Comparative Pharmacokinetics Study of Icariin and Icariside II in Rats[J].Molecules,2015,20(12):21274-21286.

[16] Xia Q.Preparation of icariside II from icariin by enzymatic hydrolysis method[J].Fitoterapia,2010,81(5):437-442.

[17] Sun D.In vitro glucuronidation of Armillarisin A:UDP-glucuronosyltransferase 1A9 acts as a major contributor and significant species differences[J].Xenobiotica,2014,44(11):988-995.

Preparation and Characterization of the Glucuronide of IcarisideⅡMENG

Fan-xing1,LI Yan2,LU Fang1,LIU Shu-min1*

(1.DrugSafetyEvaluationCenter,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,,Harbin150040,China; 2.LaboratoryofPharmaceuticalResourceDiscovery,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)

Objective：To prepare and characterize the glucuronide of icarisideⅡ. Methods：The incubation system in human liver microsomes was used to identify the glucuronidation of icarisideⅡ. The recombinant UGT1A1 was applied to prepare the glucuronide. The structure of the glucuronide was characterized by NMR spectrometry. Results：The major metabolite of icarisideⅡ was 7-O-glucuronide in human liver microsomes. Conclusion：The method of in vitro incubation can be used to prepare the glucuronide of icarisideⅡ efficiently and specificly.

IcarisideⅡ; Human liver microsomes; Glucuronide; Nuclear magnetic resonance

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No.2013CB531800)

孟繁興(1981-)，男，博士研究生，主要研究方向：藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥物代謝動力學。

劉樹民*(1963-)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥性理論及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2016-02-10

R28

A

1002-2406(2016)05-0004-03

修回日期：2016-03-25