老年白內(nèi)障患者晶狀體中20s Proteasome的表達(dá)

李 卉 田 蕊 吳 怡 王陸飛 竇文文 張 輝

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春 130041)

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老年白內(nèi)障患者晶狀體中20s Proteasome的表達(dá)

李 卉 田 蕊 吳 怡 王陸飛 竇文文 張 輝

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春 130041)

目的 探討老年性白內(nèi)障患者晶狀體中20s Proteasome表達(dá)及酶活性的變化及其與白內(nèi)障發(fā)病的關(guān)系。方法 分別應(yīng)用Western印跡法及熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)底物法檢測老年性白內(nèi)障患者晶狀體中20s Proteasome的表達(dá)及酶活性變化。 結(jié)果 隨著晶狀體混濁程度及核硬度的增加，20s Proteasome的表達(dá)及酶活性均呈下降趨勢。結(jié)論 在老年性白內(nèi)障發(fā)病過程中，20s Proteasome與晶狀體混濁程度相關(guān)。

20s Proteasome;老年性白內(nèi)障;酶活性;晶狀體

晶狀體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致老年性白內(nèi)障，晶狀體中蛋白酶的異常分解可造成晶狀體蛋白的不可逆變性〔1～3〕。20s Proteasome是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)數(shù)量最多的蛋白質(zhì)酶體，具有糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣等活性，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解中具有重要作用〔4,5〕。在氧化應(yīng)激條件下，20s Proteasome作為最主要的酶系統(tǒng)，參與組織細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)降解〔6〕，隨視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞周期的增加，其20s Proteasome的表達(dá)降低，酶活性減弱〔7〕。20s Proteasome在晶狀體中的相關(guān)研究尚未見報道。本實驗檢測老年性白內(nèi)障晶狀體20s Proteasome表達(dá)及酶活性的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009～2010年我院白內(nèi)障科行非超聲乳化小切口白內(nèi)障手術(shù)的老年性白內(nèi)障患者的晶狀體，共20枚。其中女12例，男8例，年齡60～80歲，平均72.3歲。術(shù)前對病人進(jìn)行篩查，除外并發(fā)性、代謝性、藥物及中毒性、外傷性等類型的白內(nèi)障。

1.2 實驗試劑與儀器 蛋白酶抑制劑復(fù)合物(華特生生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素膜〔PVDF膜(Amersham公司)〕；LLE-AMC(Biomol公司);預(yù)染蛋白Marker (北京全式金生物有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記酪蛋白(Sigma-Aldrich公司)；20s Proteasome蛋白一抗(人源性抗體，日本滋賀醫(yī)科大學(xué)第二生化教研室惠贈)；RP二抗(兔抗人抗體，中杉金橋公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液 (北京全式金生物有限公司)。濕性轉(zhuǎn)移電泳儀(大連競邁生物科技有限公司)；UV-2500PC (日本島津公司)；1700型紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.3 實驗分組 依據(jù)晶狀體混濁程度分為A、B兩組，每組10枚。A組：軟核或中等硬度核，顏色呈黃色、黃白色或深黃色。B組：硬核或極硬核，顏色呈棕黃色、琥珀色、棕褐色或黑色。

1.4 Western印跡檢測晶狀體中20s Proteasome表達(dá) 提取各組晶狀體總蛋白，測定樣品總蛋白濃度(A組為15.67 mg/ml，B組為61 mg/ml)，將其調(diào)至相同水平，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕性電轉(zhuǎn)、蛋白印跡及顯色反應(yīng)。其中，20s Proteasome一抗(1∶10稀釋)，4℃，過夜。二抗(1∶4 000稀釋)，室溫?fù)u床搖2 h。最后利用Bandscan灰度掃描3次取均值。

1.5 20s Proteasome蛋白酶活性的測定 同上方法提取各組樣品的晶狀體蛋白，測定總蛋白濃度，調(diào)至相同水平；分別配置3種熒光標(biāo)記蛋白底物；在37℃預(yù)熱的Eppendorf管中加入一種熒光標(biāo)記底物和組織上清液進(jìn)行混勻，1 h后加入等體積的冰乙醇終止反應(yīng)，立即讀取熒光強度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為 380 nm 和440 nm；計算反應(yīng)體系中的游離 AMC 量(7-氨基-4-甲氧基甲基香豆素)；最終結(jié)果為樣本活性與空白對照活性的差值。20s Proteasome降解發(fā)熒光底物后，結(jié)合態(tài)的熒光素轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，在適當(dāng)波長的激發(fā)光下可發(fā)出熒光。因而在底物飽和的體系中可以根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的總熒光強度來測定被降解底物的量。 樣本特定的酶活性(pmol·min-1·ml-1)是通過樣本中每毫克蛋白每分鐘降解熒光標(biāo)記底物的皮摩爾(pmol)數(shù)來表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 20s Proteasome在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá) 在預(yù)染Marker帶中蛋白分子量為30～40 kD位置附近檢測到20s Proteasome的蛋白條帶，與其分子量37 kD相符；且B組蛋白條帶比A組淺，見圖1。B組灰度值低于A組，見表1。

表1 兩組晶狀體20s Proteasome軟件分析結(jié)果(n=10)

與A組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 20s Proteasome在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達(dá)

2.2 20s Proteasome在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中酶活性的變化 B組肽酰谷氨酸肽(PGPH)、胰蛋白酶(T-L)、胰凝乳蛋白酶(CT-L)活性較A組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 20s Proteasome在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中酶活性的變化±s)

3 討 論

老年性白內(nèi)障是最常見的白內(nèi)障類型〔8,9〕，多種因素(如長期紫外線照射、氧化損傷等體內(nèi)外相關(guān)因素)可導(dǎo)致晶狀體老化后的退行性變。大部分學(xué)者認(rèn)為晶狀體蛋白的不可逆變性在白內(nèi)障形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔10～12〕。

人體內(nèi)蛋白質(zhì)含量最高的組織是晶狀體，水溶性蛋白占90%以上〔13,14〕。晶狀體蛋白的合成持續(xù)終生，晶狀體纖維的有序排列保證了晶狀體的屈光度和透明性。隨著人年齡的增長，與代謝相關(guān)的酶活性下降，人的晶狀體的代謝也相應(yīng)減慢，導(dǎo)致晶狀體透明度下降——白內(nèi)障形成。其中，變化最為顯著的是抗壞血酸、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等許多抗氧化劑〔15〕。因此，老年性白內(nèi)障主要的發(fā)生機制是氧化損傷和脂質(zhì)過氧化影響晶狀體纖維的有序排列。

20s Proteasome具有高效的降解作用，對人體組織細(xì)胞完成活躍的有氧代謝、大量蛋白質(zhì)合成、快速細(xì)胞裂解等具有重要的意義〔16,17〕。作為具有多種功能的蛋白質(zhì)降解酶，20s Proteasome負(fù)責(zé)清除氧化受損的蛋白質(zhì)，在多種年齡相關(guān)性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔18～20〕。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著晶狀體的進(jìn)行性混濁，20s Proteasome表達(dá)，同時，其酶活性減弱。其具體作用及機制尚有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

張 輝(1966-)，女，博士，教授，主要從事白內(nèi)障病因?qū)W研究。

李 卉(1984-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事白內(nèi)障病因?qū)W研究。

R778

A

1005-9202(2016)20-5125-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.090