皮膚基底細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌組織中分化抑制因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、凝血酶敏感蛋白-1、微血管密度表達(dá)狀況及意義

閆鐵夫 何曉楠 孫 健 王莉麗 付玉萍

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000)

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皮膚基底細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌組織中分化抑制因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、凝血酶敏感蛋白-1、微血管密度表達(dá)狀況及意義

閆鐵夫 何曉楠 孫 健 王莉麗 付玉萍

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000)

目的 探討皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)及鱗狀細(xì)胞癌(SCC)組織中分化抑制因子(ID)-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、凝血酶敏感蛋白(Tsp)-1及微血管密度(MVD)表達(dá)狀況及其臨床意義。方法 SCC及BCC患者各30例，取患者病理組織標(biāo)本，另選取24例正常皮膚組織樣本作為對(duì)照組。應(yīng)用免疫組化法測(cè)定各組織標(biāo)本中ID-1，VEGF，Tsp-1和微血管標(biāo)記抗體CD34的表達(dá)水平，計(jì)數(shù)腫瘤MVD；采用RT-PCR方法檢測(cè)ID-1、Tsp-1、VEGF mRNA表達(dá)情況；應(yīng)用Western印跡方法檢查ID-1、Tsp-1、VEGF蛋白水平。結(jié)果 SCC組、BCC組及對(duì)照組MVD值及ID-1、VEGF、Tsp-1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異顯著(P<0.05)，兩兩比較，SCC組、BCC組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且A組、B組間MVD值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。三組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有顯著差異(P<0.05)，兩兩組間比較也均有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論 皮膚SCC、BCC的發(fā)病與ID-1、VEGF、Tsp-1和MVD密切相關(guān)，其中ID-1與VEGF存在協(xié)同關(guān)系，能夠促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管生成，在皮膚SCC中表現(xiàn)更明顯。

ID-1；VEGF；Tsp-1；MVD；皮膚鱗狀細(xì)胞癌；基底細(xì)胞癌

臨床上非黑素性皮膚癌(NMSC)主要分為皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)與基底細(xì)胞癌(BCC)〔1〕。臨床治療的關(guān)鍵在于有效抑制腫瘤新生血管生成。機(jī)體旁分泌大量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)刺激局部腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，加速血管生成進(jìn)程。有研究證實(shí)〔2〕，分化抑制因子-1，即DNA結(jié)合抑制因子(ID)-1在多種惡性腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展及加速腫瘤血管生成的作用〔3〕。機(jī)體中存在的另外一種抑制血管生成的因子是凝血酶敏感蛋白(Tsp)-1，通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而產(chǎn)生抑制腫瘤血管生成的作用。CD34是一種與血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白，主要通過(guò)傳遞內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)信號(hào)加速血管生成，常作為腫瘤微血管密度(MVD)標(biāo)記物。本研究分析皮膚BCC和SCC組織中ID-1、VEGF、Tsp-1及MVD的表達(dá)狀況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年2月至2014年5月我院確診的SCC及BCC患者各30例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)〔4〕。患者病理組織標(biāo)本分別取自面部、頭皮、會(huì)陰及四肢等位置。另選取正常皮膚組織樣本24例作為對(duì)照組，樣本來(lái)源主要是非腫瘤移植皮膚移植者、美容者等。

1.2 藥物試劑 一抗主要是兔抗人ID-1、VEGF、Tsp-1，CD34多克隆抗體、小鼠抗人β-actin多克隆抗體〔5〕；二抗選擇辣根、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠多克隆抗體。主要藥劑選擇甲醛、甘氨酸、Western印跡電泳緩沖液、SDS、轉(zhuǎn)膜液、Tris-base、洗滌液、封閉液、洗滌液、RIPA蛋白裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白Marker、甲苯磺酰氟(PMSF)、5×上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色液、麗春紅染液、二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、定影液和顯色液等。引物序列：ID-1正鏈5'-CAAGTGGCCAGAGGCATGCACTT-3'，負(fù)鏈5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3'；Tsp-1正鏈5'-AACCGCATTCCAGAGTCTGG-3'，負(fù)鏈5'-TTCACCACGTTGTTGTCAAGGGT-3'；VEGF正鏈5'-GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3'，負(fù)鏈5'-CGATCGTTCTGTATCACTCTTTCC-3'。

1.3 免疫組化 所有組織蠟塊樣本處理采用包埋、切片、脫蠟及抗原修復(fù)。一抗兔抗人CD34采用磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶50條件下稀釋，空白對(duì)照選擇PBS代替一抗。二抗是羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)1∶200條件下稀釋，后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，樹(shù)膠封片后備用。ID-1,VEGF,Tsp-1表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是胞質(zhì)、胞膜內(nèi)存在棕黃色顆粒。MVD水平檢測(cè)采用Weidner微血管計(jì)數(shù)方法，將樣本切片放置于40倍顯微鏡下，隨后確定染色最高血管密度位置，顯微鏡觀察指標(biāo)轉(zhuǎn)換為200倍，選擇3個(gè)最高血管密度區(qū)計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，MVD值即為微血管數(shù)目的平均值〔6〕。

1.4 RT-PCR檢測(cè)ID-1,Tsp-1和VEGF mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)情況 選擇新鮮冰凍組織標(biāo)本為樣本，首先提取總RNA和擴(kuò)增RT-PCR。95℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，連續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸8 min。在瓊脂糖凝膠中將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、分離，采用紫外分析儀觀察結(jié)果并拍攝。采用Lab Works凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性電泳條帶平均灰度值，并計(jì)算各樣本基因與β-actin電泳條帶平均灰度值的比值〔7〕。

1.5 Western印跡免疫印跡法檢測(cè)ID-1，Tsp-1和VEGF蛋白水平 采用預(yù)冷過(guò)的PBS洗滌新鮮冰凍組織樣本3次，隨后將其加入裂解液400 μl中，將裂解細(xì)胞凍存30 min，4℃ 14 000 r/mim離心5 min，分離得到上清液并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜，在室溫下使用含5%胎牛血清(BSA)的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉1 h，在4℃條件下加入ID-1、VEGF與β-actin抗體(1∶500)，搖床過(guò)夜，隨后加二抗，濃度調(diào)節(jié)為1∶1 000后進(jìn)行雜交、洗膜、顯色〔8〕。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0，計(jì)量數(shù)據(jù)多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組MVD及ID-1、VEGF、Tsp-1陽(yáng)性表達(dá)率比較 三組MVD值及ID-1、VEGF、Tsp-1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異顯著(P<0.05)；兩兩比較，SCC組、BCC組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，SCC組、BCC組間除MVD值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P<0.05)，其他指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組 ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 三組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較差異顯著(P<0.05)；相對(duì)于對(duì)照組，SCC組、BCC組VEGF、ID-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯提高，Tsp-1水平顯著降低(P<0.05)。SCC組、BCC組比較，ID-1、VEGF、Tsp-1 mRNA及蛋白表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表1 各組MVD及ID-1、VEGF、Tsp-1陽(yáng)性表達(dá)率比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與BCC組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組ID-1、VEGF及Tsp-1 mRNA表達(dá)水平比較±s)

表3 各組 ID-1、VEGF及Tsp-1的蛋白表達(dá)水平比較

2.3 各指標(biāo)間相關(guān)性分析 Tsp-1表達(dá)與ID-1表達(dá)、MVD值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635、-0.736，均P<0.05)，ID-1表達(dá)與VEGF水平呈正相關(guān)(r=0.748，P<0.05)。

3 討 論

BCC作為臨床常見(jiàn)皮膚科疾病，其發(fā)病機(jī)制與基底細(xì)胞樣細(xì)胞(即生發(fā)細(xì)胞)增生有關(guān)，表現(xiàn)為圓柱、小葉、條索狀、緞帶狀，屬于惡性皮膚腫瘤〔6〕；多出現(xiàn)在頭面部，臨床病理表現(xiàn)為腫瘤表面結(jié)節(jié)、丘疹，伴隨糜爛和潰瘍等，病程進(jìn)展較慢。SCC主要源自表皮附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞，主要在老年人群中多發(fā)，屬于惡性腫瘤，發(fā)病部位多位于頭皮、面部、手背等位置，病因復(fù)雜，確診較困難。

ID蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)反式作用因子，主要包括ID-1、ID-2、ID-3及ID-4，能夠與堿性HLH蛋白(b HLH)產(chǎn)生作用，對(duì)蛋白分化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制作用，從而進(jìn)行分化抑制，因此又稱作DNA結(jié)合抑制因子。相關(guān)研究證實(shí)〔7〕ID-1蛋白可以通過(guò)參與機(jī)體內(nèi)多種信號(hào)通路，進(jìn)而影響人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，有潛在癌蛋白屬性，主要能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻斷、阻止細(xì)胞增殖，有學(xué)者稱之為準(zhǔn)原癌基因。本次研究結(jié)果顯示，ID-1的異常升高與BCC、SCC的發(fā)生有關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)論〔8〕相似。

腫瘤內(nèi)血管生成情況與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)期生存率等預(yù)后有關(guān)，而腫瘤血管生成狀況主要采用MVD作為評(píng)估金標(biāo)準(zhǔn)。本次研究結(jié)果表明，MVD值與皮膚BCC、SCC的發(fā)生有關(guān)，且皮膚SCC存在顯著新血管生成狀況。腫瘤細(xì)胞原位生長(zhǎng)需要依靠充足營(yíng)養(yǎng)，可促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生豐富血管組織，而腫瘤血管結(jié)構(gòu)往往并不完全，腫瘤轉(zhuǎn)移阻力最小，并且與外周血管相連，便于形成淋巴轉(zhuǎn)移。這同時(shí)也是皮膚SCC相對(duì)于皮膚BCC，具有惡性度高、侵襲性強(qiáng)及易轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等特點(diǎn)，導(dǎo)致腫瘤組織血液供應(yīng)缺乏。

有研究提示〔9〕Tsp-1可以抑制內(nèi)生性血管生成，其作用機(jī)制是加速腫瘤血管成熟，對(duì)化療藥物敏感性提高，降低腫瘤內(nèi)部血管密度，并減少血流量，使腫瘤組織出現(xiàn)明顯萎縮。本研究表明Tsp-1可能與抑制皮膚腫瘤有關(guān)，臨床治療方案可以選擇激活Tsp-1，增加其表達(dá)水平，從而抑制腫瘤血管生成，最終達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。ID-1對(duì)皮膚SCC、BCC的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，可能與腫瘤血管生成關(guān)系密切。ID-1促進(jìn)血管生成機(jī)制〔10〕：ID-1能夠在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，ID-1表達(dá)水平增加，能夠激活VEGF轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤血管生成；反之則抑制VEGF轉(zhuǎn)錄活性；②ID-1能夠有效抑制Tsp-1轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)腫瘤新生血管生成進(jìn)行有效調(diào)控。

綜上所述，皮膚SCC、BCC的發(fā)病與ID-1、VEGF、Tsp-1和MVD密切相關(guān)，其中ID-1與VEGF存在協(xié)同關(guān)系，能夠促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管生成，同時(shí)與腫瘤細(xì)胞分化程度、MVD值具有相關(guān)性。因此，抑制ID-1表達(dá)、阻斷VEGF活化，可能對(duì)皮膚SCC、BCC發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。

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〔2015-12-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

閆鐵夫(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事皮膚與性病方面的研究。

R73

A

1005-9202(2016)20-5051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.052