白細胞介素-6受體基因啟動子區-183A/G和外顯子9Asp358Ala多態性與肥胖的相關性

張 明 王春萍 劉一帆 張 濤 馬芙蓉 田林紅 何麗蓉

(蘭州大學第二醫院內分泌代謝科，甘肅 蘭州 730030)

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白細胞介素-6受體基因啟動子區-183A/G和外顯子9Asp358Ala多態性與肥胖的相關性

張 明 王春萍1劉一帆 張 濤 馬芙蓉 田林紅 何麗蓉

(蘭州大學第二醫院內分泌代謝科，甘肅 蘭州 730030)

目的 探討白細胞介素(IL)-6受體基因啟動子-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多態性與肥胖的相關性。方法 肥胖組268例，對照組219例，以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法分析IL-6受體基因型，并進行臨床生化檢測。結果 對照組Asp358Ala的三種基因型頻率和等位基因頻率分別為AA 28%、AC 45%、CC 27%、A 52%、C 48%，肥胖組相應為43%、46%、11%、66%、34%，肥胖組AA基因型頻率和A等位基因頻率高于對照組(P<0.01)。-183A/G三種基因型頻率和等位基因頻率兩組差異無統計學意義(P>0.05)。攜帶A等位基因的患者發生肥胖的風險是C等位基因的1.809倍(P<0.01)。結論 IL-6受體基因Asp358Ala多態性可能與中國人肥胖相關。

白細胞介素6受體；基因多態性；肥胖

脂肪能分泌數十種脂肪細胞因子、激素或其他調節物，在機體代謝及內環境穩定中發揮重要作用。白細胞介素(IL)-6是一種重要的炎性調節因子，具有多種重要的生理功能，參與糖代謝和脂代謝。而IL-6的生物學作用是通過與白細胞介素6受體(IL-6R)相結合來完成的。對IL-6R基因的掃描發現，在啟動子區-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)存在單核苷酸多態性(SNP)。SNP是一種不基于假設的無偏倚的分析方法，因而有最大可能找出疾病的易感基因〔1，2〕。近年來，在不同人種中關于IL-6R基因多態性與糖尿病、肥胖、代謝綜合征(MS)之間的研究結論不一，甚至相互矛盾。本研究探討IL-6R基因啟動子區-183A/G(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多態性與肥胖的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 肥胖組268例，男142例，女126例，平均年齡(66.2±4.2)歲，彼此之間無親緣關系，來自2005年6月至2013年9月門診和住院的患者，均符合WHO的肥胖診斷標準；對照組219例，男110例，女109例，平均年齡(64.8±3.1)歲，為同期我院進行健康體檢者；以上人群彼此無親緣關系且排除2型糖尿病、糖耐量異常、空腹血糖受損或糖耐量異常合并空腹血糖受損者，無2型糖尿病家族史，無冠心病、高血壓、腎病等。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 均測量血壓，脫鞋及穿內衣于相同條件下測身高及體重，計算體重指數(BMI)，平臍測腰圍(WC)。空腹10 h后于清晨抽取靜脈血，測定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，空腹胰島素(FINS)采用放免法測定(北京原子高科核技術應用股份有限公司，批內CV<10%，批間CV<15%)。對照組與肥胖組在性別構成比、年齡、收縮壓〔SBP，(122.7±16.5) vs (124.4±13.1)mmHg〕、舒張壓〔DBP，(78.4±9.5) vs (79.6±12.2)mmHg〕、FPG〔(4.5±0.5) vs (4.6±0.6)mmol/L〕、TC〔(4.10±0.85) vs (4.65±1.05)mmol/L〕無統計學意義。而肥胖組的WC、BMI、TG、LDL-C、FINS均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，HDL-C低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般臨床資料±s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

1.2.2 試劑 DNA抽提試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、引物、限制性內切酶BcnⅠ和HinfⅠ，以上試劑均購自北京博大泰克公司。

1.2.3 IL-6R基因啟動子和外顯子多態性的檢測 ①分離外周血白細胞，經細胞裂解液裂解，嚴格按照說明書提取外周血基因組DNA，-20℃備用。②目的基因的擴增：啟動子-183(A/G)上游引物：5′CGCAGGAGCCCGGCTCTCTACACA3′，下游引物：5′CCATCCGCTCCGGCTTTCGTAACC3′；外顯子9 Asp358Ala上游引物：5′CAGAGGAGCGTTCCGAAGG3′，下游引物：5′GTTAAGCTTGTCAAATGGCCTGTT3′。反應體系25 μl，包含10 ng(1 μl)基因組DNA，10×PCR緩沖液2.5 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，0.5 μmol/L引物各1 μl，5 U/μl TaqDNA酶0.2 μl，用18.8 μl雙蒸水補足反應體系。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35個循環。72℃終末循環8 min，置4℃終止反應(PCR反應儀：美國ABI公司GeneAMP2700)。③鑒定基因型：取PCR產物經電泳鑒定后，各取10 μl，分別以限制性內切酶BcnⅠ、HinfⅠ在37℃酶解過夜。2%瓊脂糖于80 V電壓電泳10 min，溴乙啶染色后在紫外燈下觀察基因型。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件，組間比較進行t和χ2檢驗。

2 結 果

2.1 IL-6R基因-183(G/A)和Asp358Ala多態性位點等位基因和基因型頻率分布 PCR酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下可看到：在啟動子-183(A/G)多態性檢測時，AA純合子為208 bp和11 bp兩條帶；GG純合子為143 bp、65 bp、11 bp三條帶；AG雜合子為208 bp、143 bp、65 bp、11 bp四條帶；在外顯子9Asp358Ala多態性檢測時，AA純合子為188 bp和70 bp兩條帶；CC純合子不能被切開，只有258 bp一條帶；AC雜合子為258 bp、188 bp、70 bp三條帶。啟動子區-183G/A(rs4845617)和外顯子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)的基因型和等位基因頻率分布在對照中均符合Hardy-Weinberg平衡(P值分別為0.35和0.12)。-183(G/A)基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組和對照組中差異無統計學意義(P>0.05)。而Asp358Ala的基因型頻率和等位基因頻率在肥胖組中AA基因型明顯多于對照組(P<0.01)。等位基因分布分析提示，A等位基因頻率在肥胖組中多見(P<0.01)。在等位基因頻率的比較中，OR值為1.809 (95%CI1.397 ～2.344)，即攜帶有A等位基因發生肥胖的風險是C的1.809倍。見表2。

表2 兩組IL-6R基因Asp358Ala和-183(G-A)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.2 IL-6R基因Asp358Ala各基因型與WC和BMI的相關性 Asp358Ala不同基因型(AA、AC、CC)間比較，WC〔(92.3±9.8)，(87.9±8.9)和(85.8±9.4)cm，P<0.01〕和BMI〔(30.5±5.3)，(28.5±4.7)和(26.1±3.8)kg/m2，P<0.01〕差異有統計學意義。外顯子9的Asp358等位基因純合子的WC和BMI高于其他基因型攜帶者。

3 討 論

IL-6是多功能細胞因子，通過對多種靶細胞的作用，對細胞的生長、分化及某些基因的表達發揮調節和誘導作用，參與糖代謝和脂代謝〔3〕。IL-6與肥胖的關系非常密切，IL-6R基因位于染色體1q21.3，-183G/A(rs4845617)是位于IL6R基因啟動子區的變異，該位點是核因子(NF)-1的結合位點，NF-1對IL-6R基因有激活和阻遏作用，從而影響IL-6R基因的轉錄和表達〔4〕，推測可能會影響糖代謝和脂代謝。但在本研究中-183G/A(rs4845617)的多態性和肥胖無關，說明-183A/G變異在甘肅漢族人群中對肥胖無影響。Asp358Ala(rs8192284 A/C)是位于外顯子9的A/C多態性，可引起錯義突變，引起Asp358Ala的氨基酸替代。

近年來國內外對IL-6R基因多態性與肥胖、2型糖尿病、MS的關系的研究結論不一。有研究顯示，在Pima印第安人〔5〕中啟動子區-183G/A(rs4845617)和外顯子9 Asp358Ala(rs8192284 A/C)的多態性與肥胖相關，但在美國白人〔6〕和丹麥白人〔7〕中外顯子9的A/C多態性與肥胖無關而與2型糖尿病相關。這說明該位點多態性的影響在不同種族存在差異。即使在中國漢族人群中的研究，結論也不一致，閆彩鳳等〔8〕認為rs4845617和rs8192284多態性在北京人群中與BMI和WC相關，而Jiang等〔9〕在廣州人群中提示該多態性與肥胖不相關而與血糖和MS相關。本課題組既往在甘肅漢族人群中的研究發現〔10,11〕，IL-6R基因Asp358Ala與2型糖尿病和MS相關。本研究為避免糖代謝異常對IL-6R基因多態性基因型分布和等位基因頻率的影響，在樣本的選擇上剔除了2型糖尿病、糖耐量異常、空腹血糖受損以及糖耐量異常合并空腹血糖受損的患者。 本文結果發現，rs8192284的多態性與甘肅漢族人中的肥胖有相關性，Asp等位基因攜帶者與Ala等位基因攜帶者比較，肥胖的易感性增加，說明Asp358純合子發生肥胖的危險性較高。

IL-6R基因Asp358Ala導致肥胖易感性增加的可能機制是基因變異影響了可溶性白細胞介素6受體(sIL-6R)水平，但是sIL-6R的減少通過哪些機制來增加肥胖的易感性，目前仍不太清楚。

總之，甘肅人群中發現IL6R基因外顯子9Asp358Ala和啟動子-183(A→G)存在多態性，而且外顯子9Asp358Ala多態性與肥胖易感性有關聯。但肥胖是一種多基因及環境因素聯合作用的病因復雜疾病。對于大多數的肥胖來說，是否存在一個或幾個主效基因目前尚未肯定，還需要更大樣本的深入研究。

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〔2015-05-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

甘肅省自然科學基金(No.1506KJZA239);蘭州市科技計劃項目(2011-2-61)；甘肅省科技支撐計劃-社會發展計劃項目(No.0708NKCA099)

王春萍(1972-)，女，副主任醫師，主要從事小兒內分泌基礎與臨床研究。

張 明(1970-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事內分泌代謝病基礎與臨床研究。

R589

A

1005-9202(2016)20-5021-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.036

1 蘭州市婦幼保健院兒科