Nrf2-抗氧化反應元件信號通路對腦損傷大鼠的神經保護作用及機制

薛毅輝 陳富勇 吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫科大學附屬第一醫院神經外科，福建 福州 350005)

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Nrf2-抗氧化反應元件信號通路對腦損傷大鼠的神經保護作用及機制

薛毅輝 陳富勇1吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫科大學附屬第一醫院神經外科，福建 福州 350005)

目的 研究Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)信號通路對腦損傷大鼠的神經保護作用及機制。方法 將60只SD大鼠隨機分為2組，其中假手術組4只，模型組56只。模型組分為A組和B組：A組于手術前24 h腹腔注射特丁基對苯二酚(tBHO)50 mg/kg(5 mg/ml)，B組注射等量生理鹽水。比較假手術組和模型組術后神經行為評分、腦組織含水量和神經細胞凋亡率。比較A組和B組不同時刻(術后1、3、6、12、24 h，3、7 d)的單核細胞血紅素氧合酶(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平。結果 各組神經行為評分，腦組織含水量，凋亡率差異具有統計學意義(P<0.05)。各組術后不同時刻的HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Nrf2-ARE通路主要通過上調下游抗氧化酶的表達發揮對腦損傷大鼠神經保護作用。

Nrf2-ARE通路；腦損傷；氧化應激反應；抗氧化酶

顱腦損傷的病理生理過程包括原發性和繼發性腦損傷，其特點是腦皮質及白質搓碎、破裂，出血、水腫，血管栓塞，部分神經細胞壞死；后者包括一系列的損傷級聯反應，主要包括氧化應激、炎癥和神經細胞凋亡等，其中氧化應激是繼發性腦損傷的病理生理機制〔1〕。針對顱腦損傷的復雜病理生理機制，臨床上尚未出現有效的干預措施，故患者預后較差。目前，Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)通路在腦損傷中的作用引起了較為廣泛的關注〔2〕，本次研究旨在探討Nrf2-ARE信號通路對腦損傷大鼠的神經保護作用及機制。

1 資料與方法

1.1 動物、主要儀器及試劑 SD大鼠60只，體重為200～220 g，平均(210.0±6.2)g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，合格證號14-0212。主要儀器及試劑為Elx800光吸收酶標儀〔美國伯騰(北京)儀器有限公司〕、改良液壓沖擊裝置(中國天津醫科大學總醫院)、BX53電子顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、Image-Pro Insight 圖像分析軟件(廣州市明美光電技術有限公司)、Gallios流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)、特丁基對苯二酚(tBHQ，上海棋成實業有限公司)、細胞凋亡測試盒(UNNEL法，上海博耀生物科技有限公司)、抗Nrf2抗體和抗β-actin抗體〔艾博抗(上海)貿易有限公司〕、大鼠單核細胞血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)、大鼠醌氧化還原酶(NQO)1單克隆抗體(上海古朵生物科技有限公司)、大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA分析檢測試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)、羊抗鼠多克隆抗體(北京中杉金橋公司)、蛋白定量檢測試劑盒(美國Pierce公司)、電化學發光(ECL)底物(瑞典CE life science公司)。

1.2 實驗動物分組及模型構建 對大鼠進行分組，其中假手術組4只，模型組56只。均進行適應性培養1 w。大鼠實驗前禁食12 h：模型組根據隨機數字表法分為A組，術前24 h給予腹腔注射Nrf2激動劑tBHQ，每隔8 h給藥1次(5 mg/ml)，每次劑量為16.7 mg/kg，共3次，總計50 mg/kg；B組同時給予等量生理鹽水。大鼠經2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉后，在無菌條件下沿頭部正中矢狀位切開皮膚、皮下組織，剝離顱骨外膜，在距離矢狀縫、冠狀縫5 mm處用磨鉆鉆取直徑0.5 cm的小孔，保持硬腦膜完整，使用改良液壓沖擊裝置造模，壓力為0.2 MPa。假手術組常規麻醉、開顱，但不行液壓沖擊。觀察大鼠恢復自主呼吸即放回飼養籠，進行損傷后觀察〔3〕。 分別將A組4只大鼠和B組4只大鼠于相應時間點處死，取材對腦挫傷灶及其周圍區進行組織學觀察。

1.3 大鼠的神經行為學評分 術后24 h進行大鼠腦損傷神經功能評分，采用雙盲法〔4〕。

1.4 腦組織含水量測定 術后24 h用濾紙吸除標本表面水分，分析天平稱濕重后于110℃恒溫干燥箱內干燥24 h至 恒重，稱干重后按Elliot公式〔腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〕計算腦含水量〔5〕。

1.5 組織學觀察 ①神經細胞凋亡率：術后24 h取腦組織進行組織染色的標本用4%多聚甲醛固定并進行組織學檢查。對組織進行轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(TUNEL)染色并在顯微鏡下(×400)觀察凋亡細胞(細胞核出現棕黃染顆粒)，在鏡下分5個視野計數細胞并計算凋亡率。凋亡率=(凋亡細胞/總細胞數)×100.00%。②大鼠Nrf2表達水平檢測：手術后1、6、12、24 h，3、7 d采用Western印跡檢測大鼠Nrf2表達水平。取新鮮腦組織裂解、勻漿后取上清液，蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉移和膜封閉，封閉結束后分別滴加Nrf2大鼠單抗4℃孵育過夜。加入二抗室溫下于搖床孵1 h，二抗孵育后顯色、曝光、顯影。測量并分析上述蛋白的光密度值，并以β-actin為內參計算相對光密度值(ROD)。③大鼠抗氧化與氧化物質水平的檢測：別于手術后1、6、12、24 h，3、7 d檢測大鼠HO-1，NQO1，GSH和ROS水平。HO-1和NQO1采用Western印跡法，方法同②。 GSH采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，ROS檢測采用流式細胞法，操作嚴格按照說明書進行。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠神經行為學評分及腦組織含水量 各組神經行為學評分和腦組織含水量差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠神經細胞凋亡率比較 假手術組神經細胞凋亡率(1.17±0.23)%，A組(23.98±4.17)%，B組(47.65±8.96)%，差異具有統計學意義(F=7.984，P<0.05)。

2.3 大鼠不同時點的Nrf2表達水平比較 A組和B組術后不同時點的Nrf2的ROD高于假手術組，A組和B組不同時刻的Nrf2ROD不同(P<0.05)。見表2。

2.4 大鼠不同時點HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平 各組術后不同時點HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異顯著(P<0.05)。見表3、表4。

表1 各組神經行為學評分及腦組織含水量比較±s,n=4)

與假手術組相比：1)P<0.05

表2 各組術后不同時點Nrf2 ROD水平比較

與A組比較：1)P<0.05

表3 各組術后不同時點HO-1和NQO1水平比較

表4 各組術后不同時點GSH和ROS水平比較

3 討 論

顱腦損傷的病理生理過程包括機械性沖擊造成的原發性損傷和損傷后啟動的一系列生化過程引起的繼發性、進行性神經細胞損傷即繼發性腦損傷〔6〕。后者則一般持續數小時至數天，是在首次損傷后啟動的包括一系列生化降解過程的損傷級聯反應，主要包括興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥和凋亡，由自由基造成的氧化損傷成為繼發性腦損傷的重要原因之一〔7，8〕。為改善顱腦損傷者的預后，臨床上除避免或減輕原發性腦損傷外，還應該對繼發性腦損傷進行干預。

顱腦損傷大鼠存在氧化應激、鈣紊亂、線粒體毒性、炎癥和凋亡等一系列病理生理變化：同時，大鼠體內存在抗氧化應激系統〔9〕。Nrf2反應性表達增加，引起下游ARE元件及包含的HO-1和NQO1等抗氧化酶的表達水平增高，從而發揮抗氧化作用。大鼠術后的GSH水平明顯降低，而ROS水平增加，說明抗氧化能力減弱。Nrf2是具有基本亮氨酸拉鏈結構的一種核轉錄因子，正常情況下存在于胞質內，一種Keap1蛋白可以特異結合在Nrf2的氨基端，使Nrf2的活性受到抑制。當誘導劑存在的情況下，Nrf2磷酸化，向細胞核內轉移。磷酸化的Nrf2進入核內后，通過P38/ERK/JNK途徑與Maf蛋白形成異二聚體，并與ARE結合〔10〕。ARE是順式作用元件的一段增強子序列，NQO1、HO-1等基因序列中都存在ARE序列。因此，ARE介導細胞內參與氧化應激的基因轉錄水平的激活，Nrf2-ARE信號的激活能夠上調多種抗氧化酶、解毒酶的表達，抑制炎性反應，強力升高細胞保護功能〔11〕。本研究說明Nrf2-ARE通路對腦損傷大鼠的神經系統具有保護作用，而tBHQ的可以通過上調Nrf2表達減輕大鼠的腦水腫和神經細胞凋亡〔12〕。

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11 吳 丹.HO-1調控Nrf2-ARE信號通路對腦出血后神經保護作用的實驗研究〔D〕.南昌：南昌大學醫學院，2014.

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〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省屬高?？蒲袑ｍ楉椖?No.JK2012021)

薛毅輝(1962-)，男，副主任醫師，主要從事顱腦損傷和顱底中線腫瘤研究。

R285.6

A

1005-9202(2016)20-4953-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.006

1 深圳市第二人民醫院功能神經科