BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌中的表達及臨床病理意義

張 科 梅金紅 蔡 勇 王立超

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BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌中的表達及臨床病理意義

張 科 梅金紅 蔡 勇 王立超

目的 探討BRCA1、Ki67在不同分子分型乳腺癌進展中的作用、臨床病理意義。方法 應用熒光原位雜交技術(FISH)，對免疫組化方法檢測Her2為2+以上(包含2+)的腫瘤蠟塊做進一步檢測，FISH檢測出陽性表達的腫瘤蠟塊定義為Her2最終陽性表達，并依據《2013版中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范的標準》對乳腺浸潤性導管癌進行分子分型，依據分子分型將乳腺癌分為五類Luminal A型，Luminal B like型，Luminal B樣型，Her2過表達型和基底細胞樣型，各分型分別選取20例，總共100例乳腺浸潤性導管癌病例。采用免疫組化二步法對入選病例的腫瘤組織進行BRCA1及Ki67蛋白的檢測。結果 BRCA1蛋白陽性表達率在Luminal A型組，Luminal B like型組，Luminal B樣型組，Her2過表達型組，基底細胞樣型組中差異具有明顯顯著性(P<0.05)；BRCA1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移情況、ER/PR狀態、Her2狀態均無關(P均>0.1)；Ki67高指數表達率在Luminal A型組，Luminal B like型組，Luminal B樣型組，Her2過表達型組，基底細胞樣型組中差異具有明顯顯著性(P<0.05)；年齡組≤59歲的Ki67高指數表達率較年齡組≥60歲的增高，差異有統計學意義(P<0.1)；ER/PR陰性組和Her2陽性組的Ki67高指數表達率較ER/PR陽性組和Her2陰性組增高，差異具有統計學意義(P<0.1)；Ki67表達與腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移等臨床病理指標無相關性(P均>0.1)；BRCA1與Ki67在各亞型乳腺癌中的表達呈負相關性(P<0.05)。結論 聯合檢測BRCA1和Ki67對不同分子分型乳腺癌有一定的預測預后價值。

乳腺腫瘤；不同分子分型乳腺浸潤性導管癌；BRCA1；Ki67；免疫組織化學；FISH檢測

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1582～1586)

乳腺癌是嚴重威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一。因其具有高度異質性，即使組織學類型、臨床分期、治療模式均相同，預后也存在著較大的差別。隨著分子生物學理論和技術的發展，乳腺癌分子分型方法應運而生。由于其更加適應臨床治療及預后評估的需要，被越來越多的人所接受[1]。乳腺癌易感基因1(BRCA1)，是目前發現的與乳腺癌發生相關的最關鍵的抑癌基因。BRCA1表達發生異常者極有可能會引起細胞代謝和增殖的紊亂，甚至發生癌變。Ki-67 是由Gerdes 等[2]發現的1種與細胞有絲分裂周期密切相關的增殖細胞核抗原,可用來識別生長中正常細胞和腫瘤細胞,評估細胞的增生程度。BRCA1基因的突變攜帶情況與乳腺癌臨床、預后關系雖已經基本明確[3]，但是由于目前國內技術的局限性，目前臨床開展較多的還是通過免疫組化方法來檢測BRCA1蛋白的表達情況，而BRCA1蛋白在癌組織中表達的臨床意義和能否作為乳腺癌預后的因素還未能明確，并且BRCA1蛋白表達水平和Ki67的關系研究甚少。本次研究將應用免疫組織化學方法及熒光原位雜交技術(FISH)對乳腺浸潤性導管癌病例進行分子分型，并通過免疫組織化學二步法檢測BRCA1、Ki67蛋白在各分子分型乳腺癌中的表達情況，以探討其在不同分子分型乳腺癌進展中的作用及臨床意義，并研究BRCA1與Ki67之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集江西省腫瘤醫院2013年10月至2015年10月住院手術的、并經免疫組織化學檢測(ER、PR、Her2、CK5/6、EGFR、Ki67等)和熒光原位雜交方法(FISH)檢測從而明確分子分型的總共100例乳腺浸潤性導管癌病例及其臨床病理資料。乳腺癌各分子分型免疫組化抗體表達情況見表1，各分子分型組均隨機選取20例，并采用免疫組織化學二步法檢測以上收集病例的BRCA1蛋白的表達。選取的病例均為女性，年齡26～75歲，腫塊大小1～10 cm。診斷、組織學分級、分期標準參考《2013版中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》[4]：病理組織學分級Ⅰ級0例，Ⅱ級74例，Ⅲ級26例?；颊咝g前均未行新輔助化療和放射治療。

表1 乳腺癌各分子分型免疫組化抗體表達情況

1.2 免疫組織化學染色

采用免疫組化二步法，嚴格按照操作說明書進行實驗。BRCA1抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，其他相關指標抗體及實驗試劑均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。ER、PR染色結果判定標準：細胞核內出現黃色或棕黃色顆粒且細胞數≥1%為陽性，相反則為陰性，ER、PR中任意一個為陽性則記為ER/PR陽性，若都為陰性則為ER/PR陰性；Her2染色結果判定：0：無任何著色；1+：任何比例的浸潤性癌細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色；2+：>10%的浸潤性癌細胞呈現弱至中等強度、完整但不均勻的細胞膜呈棕黃著色或<30%的浸潤性癌細胞呈強且完整的細胞膜棕褐色著色；3+：>30%的浸潤性癌細胞呈現強且完整的細胞膜棕褐色著色。其中0和1+判定為Her2陰性，2+為不確定，3+為Her2陽性(Her2免疫組化檢測2+或3+均需行FISH檢測以明確其最終表達)；Ki67染色結果判定：胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，計數10個高倍視野腫瘤細胞中陽性細胞數，并計算陽性比率：<14%為低指數表達，≥14%為高指數表達；BRCA1染色結果判定標準：以腫瘤細胞胞質或胞核內出現棕黃色顆粒且數量>10%為陽性，≤10%為陰性。

1.3 熒光原位雜交技術(FISH)檢測

FISH試劑盒由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供。對HER2免疫組化檢測為(2+)或(3+)者再進行FISH檢測，基因擴增表達者記為最終HER2陽性，不表達者記為Her2陰性。

1.4 統計處理

應用SPSS 17.0統計軟件包進行實驗數據的分析，BRCA1、Ki67表達與臨床指標之間的關系分析采用校正的χ2Pearson檢驗，P<0.1為差異有顯著性，P<0.05為差異具有明顯顯著性；BRCA1與Ki67間相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 BRCA1、Ki67蛋白表達在不同分子分型乳腺癌中的陽性率

BRCA1蛋白陽性表達率在Luminal A型組，Luminal B like型組，Luminal B樣型組，Her2過表達型組，基底細胞樣型組中分別為95.0%(19/20)，85.0%(17/20),55.0%(11/20),80.0%(16/20)，75.0%(15/20)。結果顯示BRCA1在Luminal A型組表達最高，其次是在Luminal B like型組、Her2過表達型組及基底細胞樣型組，而在Luminal B樣型組中表達最低。Luminal B樣型乳腺癌中BRCA1陽性表達率明顯低于其他四型乳腺癌(P<0.05)，見表2。

表2 BRCA1蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達情況/例

Ki67高指數表達率在Luminal A型組，Luminal B like型組，Luminal B樣型組，Her2過表達型組及基底細胞樣型組分別為0(0/20)，85.0%(17/20)，100%(20/20)，75.0%(15/20)和85.0%(17/20)。結果顯示：Ki67高指數表達率在Luminal B樣型組最高，其次在Luminal B like型組、基底細胞樣型組及Her2過表達型組，而在Luminal A型組中表達最低。Luminal A型乳腺癌中Ki67高指數表達率明顯低于其它四型乳腺癌(P<0.05)，見表3。

2.2 BRCA1、Ki67表達與各亞型乳腺癌臨床病理因素的關系

BRCA1蛋白表達與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移情況、ER/PR狀態、Her2狀態均無關(P均>0.1)。

表3 Ki67蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表達情況/例

Ki67高指數表達率在年齡<40歲組、年齡40～59歲組及年齡≥60歲組分別為61.1%(11/18)，75.8%(50/66)和50.0%(8/16),其在40～59歲年齡組中表達最高，其次為<40歲年齡組，而在≥60歲年齡組中表達最低，年齡組≤59歲的Ki67高指數表達率較年齡組≥60歲的增高，差異有統計學意義(P<0.1)；Ki67表達與腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移情況均無關(P>0.1)； ER/PR陰性組和Her2陽性組的Ki67高指數表達率較ER/PR陽性組和Her2陰性組增高，差異具有統計學意義(P<0.1)，見表4、表5。

表4 BRCA1表達與臨床病理特征的關系/例

注：BRCA1為乳腺癌易感基因1；ER為雌激素受體；PR為孕激素受體；Her2為人表皮生長因子受體2。

表5 Ki67表達與臨床病理特征的關系/例

注：BRCA1為乳腺癌易感基因1；ER為雌激素受體；PR為孕激素受體；Her2為人表皮生長因子受體2。

2.3 BRCA1與Ki67的關系

Spearman相關性分析得出，BRCA1與Ki67在各亞型乳腺癌中的表達呈負相關，γ=-0.199，P<0.05,見表6。

表6 BRCA1與Ki67表達在各亞型乳腺癌中的關系/例

3 討論

近年來，隨著基因表達譜和分子生物學深入研究，乳腺癌分子分型能反映腫瘤的生物學行為并能幫助判斷預后和選擇治療方案[5],楊利利等[6]研究顯示：Luminal A型乳腺癌復發和遠處轉移風險較低，預后較好；而Luminal B型相對Luminal A型侵襲性較高，預后較差。國外早有研究報告了原癌基因HER2的擴增，并指出HER2多拷貝性質可導致腫瘤復發和臨床預后較差。目前多項研究證實HER2蛋白的過表達(HER2過表達型乳腺癌)是乳腺癌預后不良因素之一，Livasy等[7]研究表明基底細胞樣乳腺癌具有較高的增殖指數和不良的臨床預后。

在2011年St.Gallen國際乳腺癌的會議上，將最新乳腺癌分型標準提出來，Ki67作為區別激素受體型Luminal A型和Luminal B型的關鍵因素，閾值定為14%。Ki67與ER、PR、Her2等[8]指標一樣被確定為判定乳腺癌臨床預后轉歸的獨立因素。從而Ki67指數大于14%反映了腫瘤細胞的增殖活躍高，惡性程度相對高，侵襲性較大并且預后相對差[9]，本次研究中，Ki67高指數表達率在Luminal B樣型組最高，其次在Luminal B like型組、Her2過表達型組及基底細胞樣型組，而在Luminal A型組表達率最低，其在Luminal A型組中的高表達率顯著低于其他四種亞型(P<0.05)，表明相對于其他四種分子分型乳腺癌，Luminal A型乳腺癌其腫瘤細胞的增殖活躍低，惡性程度相對低，侵襲性較小并且預后相對好。這與楊利利等[6]研究結果相符。本次研究亦可見年齡組≤59歲的Ki67高指數表達率較年齡組≥60歲增高(P<0.1)； ER/PR陰性組和Her2陽性組的Ki67高指數表達率較ER/PR陽性組和Her2陰性組增高(P<0.1)，符合相關研究結果[10]。但Ki67表達與腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移情況均無關。

BRCA1是近年來發現的與乳腺癌發展有關的重要抑癌基因，其對細胞周期起著負調控作用。變異的BRCA1基因編碼的蛋白功能缺失或降低致使細胞分化障礙，失去調控細胞增殖的作用進而導致細胞惡性轉化引發腫瘤。有研究表明BRCA1的表達缺失或低表達與組織低分化和腋窩淋巴結轉移有關[11]；汪菲等[12]研究表明，BRCAl的表達與雌二醇受體(ER)呈負相關，BRCAl的表達對乳腺癌細胞ER的表達有著抑制作用，因而降低細胞對雌激素的敏感度。而本次研究中，BRCA1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、腫瘤距乳頭距離、組織學分級、腋窩淋巴結轉移情況、ER/PR狀態、Her2狀態均無關。這可能與入選病例的個體特異性有關，日后還需進一步擴大病例數量來探究BRCA1與以上臨床病理資料之間的相互關系。有研究發現BRCA1陰性者的無瘤生存率明顯低于陽性者，因此BRCA1基因突變和BRCA1蛋白表達下降均提示較差的預后。本次研究顯示BRCA1與Ki67表達呈負相關(P<0.05)，表明BRCA1參與細胞周期的負調控，其表達減少可促進腫瘤細胞的增殖，因此，BRCA1基因突變和BRCA1蛋白表達下降均提示預后較差，但其具體機制還有待進一步研究證實。本次研究中，BRCA1陰性表達率在Luminal B樣型組明顯高于Her2過表達型組、Luminal B like型組、基底細胞樣型組及Luminal A型組(P<0.05)，并且在Luminal A型組中所占比例最低。這與楊利利等[6]提及的Luminal A型乳腺癌復發和遠處轉移風險較低，預后較好而Luminal B型相對Luminal A型侵襲性較高，預后較差； Livasy等[7]研究出的基底細胞樣乳腺癌具有較高的增殖指數和不良的臨床預后等一系列研究結果相符。但由于本次入選研究的病例數量的限制，并未進一步發現BRCA1的表達在Luminal A型組、Luminal B like型組、Her2過表達型組以及基底細胞樣型組之間的差別，而對于BRCA1表達在Luminal B型乳腺癌的兩種亞型Luminal B樣型和Luminal B like型之間出現差別的原因也有待進一步探究。因此，聯合檢測BRCA1和Ki67對不同分子分型乳腺癌有一定的預測預后價值，必要時可擴大樣本量，進一步研究兩者對乳腺癌分子分型關系的影響和相互作用。

綜上所述，BRCA1蛋白表達缺失或減少，Ki67高指數表達均可作為判斷乳腺癌預后不良的因素，由于其檢測手段相對簡單且費用低，檢測結果簡潔明了，兩者聯合檢測可廣泛應用于基層醫院，從而為臨床醫師早期判斷乳腺癌患者的臨床預后提供重要線索。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Pathological Significance of BRCA1 and Ki67 Expression in Different Molecular Classification of Breast Cancer

ZHANGKe,MEIJinhong,CAIYong,etal.

JiangxiProvinceCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To investigate the effect of BRCA1 and Ki67 in different molecular subtypes of breast cancer,and its clinical pathological significance.Methods Testing the tumor wax block by using FISH method which were Her2 2+ or 3+ detected by immunohistochemical method.FISH method showed the positive expression of tumor wax block was defined as Her2 positive expression,eventually.Classificating breast invasive ductal carcinoma in molecular classification according to the 2013 edition of the Chinese anti-cancer association guidelines and normative standard of diagnosis and treatment of breast cancer,and the breast cancer can be divided into 5 subtypes in molecular classification：Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group,basal-like subtype group.Select 15 cases from each subtype,total of 75 cases of breast invasive ductal carcinoma.Detected BRCA1 and Ki67 protein in each tumor tissues by immunohistochemical SP method and analyzed its relationship with the clinical pathological indicators.Results Positive expression rate of BRCA1 protein had obviously significant difference in the Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group and basal-like subtype group (P<0.05);There were no significant differences with the expression of BRCA1 protein and age,tumor size,tumor distance from the nipple,histological grade and axillary lymph node metastasis,ER/PR status as well as Her2 status(P>0.1);High index expression rate of Ki67 had obviously significant difference in the Luminal A subtype group,Luminal B like subtype group,Luminal B subtype group,Her2 over-expression subtype group and basal-like subtype group (P<0.05);High index expression rate of Ki67 in the ≤59 group was more than ≥60 group,the difference was statistically significant (P<0.1);High index expression rate of Ki67 in ER/PR negative group and Her2 positive group was more than that in ER/PR positive group and her2-negative group,the difference had statistical significance (P<0.1);There were

Breast neoplasms;Different molecular classification of breast invasive ductal carcinoma;BRCA1;Ki67;Immunohistochemistry;FISH detection

330029 江西省腫瘤醫院(張 科,蔡 勇)；330000 南昌大學第一附屬醫院(梅金紅，王立超)

王立超

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.005

R737.9

A

1001-5930(2016)10-1582-05

2016-07-20

2016-08-09)

no significant differences in the expression of Ki67 protein and tumor size,tumor distance from the nipple,histological grade as well as axillary lymph node metastasis(P>0.1);The expression of BRCA1 and Ki67 in different subtypes of breast cancer showed a negative correlation (P<0.05).Conclusion Joint detection of BRCA1 and Ki67 in different molecular classification of breast cancer might play an important role in predicting clinical outcomes.