乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達及其臨床意義

張碩穩 楊 微 王新樂 宋 姮 宋振川

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乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達及其臨床意義

張碩穩 楊 微 王新樂 宋 姮 宋振川

目的 觀察乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達及與其臨床病理指標的相關性。方法 分別采用實時熒光定量PCR及免疫組織化學法，對70例乳腺癌組織和癌旁組織行MTDH、IκB、NF-κB P65的mRNA及蛋白檢測，同時分析三者與臨床病理指標的相關性。結果 乳腺癌組織中MTDH、NF-κB P65 mRNA及蛋白表達水平均高于癌旁組織(P<0.05)，乳腺癌組織中IκB mRNA及蛋白表達水平低于癌旁組織(P<0.05)；MTDH、IκB、NF-κB P65的表達與乳腺癌的臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論 乳腺癌中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達可能參與了乳腺癌的發生發展。

乳腺癌；MTDH；IκB；NF-κB；P65；實時熒光定量PCR；免疫組化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1578～1581)

乳腺癌(breast cancer)為當今女性最常見的惡性腫瘤，約占惡性腫瘤總數的23%，占女性癌癥死亡人數的14%[1]。全世界每年約130萬新增乳腺癌患者，其中約46.5萬人死于乳腺癌。我國作為發展中國家，隨著人們生活水平的提高，飲食結構改變以及生育模式的變更，乳腺癌的發病率呈現逐年上升趨勢[2]。2014年Fan Lei[3]發表在Lancet Oncol 的調查顯示，中國每年乳腺癌的新增數量和死亡人數分別占世界的12.2%和9.6%。乳腺癌的發生是多種因素共同作用的結果，包括遺傳因素、生活方式以及多種原因導致的基因變異。近年來，隨著分子生物學研究的不斷發展和廣泛的應用，對乳腺癌的發病機制有了更深層次的研究，諸多研究證實，MTDH，IκB，NF-κB P65均參與了乳腺癌的演變過程，在腫瘤發生、發展、治療及預后等多方面發揮著重要作用。

本實驗通過實時熒光定量PCR及免疫組織化學法分別檢測MTDH、IκB、NF-κB P65三者在乳腺癌組織及癌旁正常組織(距離癌灶>5 cm)中mRNA及蛋白質含量，并結合患者臨床資料及病理學結果，進一步探討三者與臨床病理指標的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床資料 選取2014年01月至2014年07月河北醫科大學第四醫院乳腺中心原發性乳腺癌患者70例，均為女性，年齡31～80歲，中位年齡52歲。于手術切下標本20 min內用無菌手術刀片迅速切取乳腺癌組織及正常乳腺組織(距癌灶>5 cm)標本，一式兩份，一份立即置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲存液(4 ℃過夜后轉至-20 ℃冰箱儲存)，另一份置于10%福爾馬林液(-20 ℃冰箱儲存)中備用。切取標本器械及無酶離心管均經滅菌處理。統計分析時各個臨床病理生物學指標分組情況如下：分為年齡≤50歲組和>50歲組；腫瘤直徑≤2 cm組和>2 cm組；乳腺癌臨床分期參照2010年出版的美國腫瘤聯合會(AJCC)乳腺癌分期法(第7版)，Ⅰ期25例，Ⅱ期35例，Ⅲ期10例；病理類型分為浸潤性癌和非浸潤性癌；ER判定標準依據2010年美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理醫師學院(CAP)聯合制定并發布的乳腺癌激素受體免疫組化檢測指南，其規定≥1%的細胞核染色陽性即激素受體陽性；Her-2結果依據美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理醫師學院(CAP)制定的HER2檢測指南：Her-2陽性為IHC HER2 3+或FISH HER2基因擴增；Ki-67表達分為<14%和≥14%[4]。

1.1.2 實驗試劑 RNAiso Plus購于TaKaRa公司，ReverAid First Strand cDNA Synthesis購于Fermentas Inc，Real-Time PCR引物購于上海生工合成；YBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于TaKaRa公司，MTDH兔多抗購于北京中杉金橋生物公司，IkB 兔多抗及P65兔多抗購于Cell signaling Inc。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR法 標本總RNA的提取參照Trizol使用說明書進行，反轉錄合成第一鏈cDNA擴增目的基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：MTDH上游引物為5'-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3'，下游引物為5'-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3'；IκB上游引物為5'-TGAGGACCAGCAGTGTCTTG-3'，IκB 下游引物為5'-CATCGTTGATCACAAGTCGG-3'；NF-κB P65 上游引物為5'-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3'，NF-κB P65下游引物為5'-TGGTCCCGTGAAATACACCT-3'。 以β-actin作為內參基因，β-actin上游引物為5'-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3'，下游引物為5'-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3'。擴增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。數據分析：用 2-△△Ct法分析所得 real-time PCR 數據，兩樣本之間的數據比較使用 Student's t test 進行。

1.2.2 免疫組織化學法 標本經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，以 4 μm 為標準連續切片，在切片漂烘溫控儀內38 ℃將連續切片展開，用處理后的載玻片撈取切片，脫蠟，采用高溫高壓修復抗原，免疫組化染色按SP試劑盒說明書進行。MTDH蛋白陽性表達為在胞質中見棕黃色或棕褐色染色。按染色強度：無著色為0分，輕度著色1分，中度著色2分，重度著色3分。按陽性細胞率：無陽性細胞為0分，0～20%為1分，20%～50%為2分，50%～70%為3分，>70%為4分。在400倍視野下隨機選5個區域，免疫組化結果根據兩者乘積計分(每張切片可能出現的計分包括：0、1、2、3、4、6、8、9、12分)：<4分為低表達，≥ 4分為高表達[5]。IκB、NF-κB P65陽性染色為細胞核或(和)細胞質中呈棕褐色。按染色強度：陰性為0分，淺黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分。按陽性細胞數：無陽性細胞為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。免疫組化結果根據兩者乘積計分：0～3分為正常表達，>3分為過表達[6]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65 mRNA的表達情況

采用實時熒光定量PCR方法，檢測MTDH、IκB、NF-κB P65在癌組織中的表達水平分別為30.78±1.66、31.37±1.55、31.35±1.90；MTDH、IκB、NF-κB P65在癌旁正常組織中的表達水平分別為29.62±1.95、32.82±1.66、30.55±1.92。癌組織中MTDH、NF-κB P65表達水平均高于癌旁正常組織，癌組織中IκB表達水平低于癌旁正常組織，具有統計學意義。

2.2 乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的蛋白表達水平

MTDH蛋白陽性表達為胞質中見棕黃色或棕褐色染色。IκB、NF-κB P65陽性染色為細胞核和(或)細胞質中呈棕褐色。采用免疫組織化學法，檢測MTDH、IκB、NF-κB P65在癌組織中高表達率分別為80.00%(56/70)、17.14%(12/70)、58.57%(41/70)；在癌旁正常組織中高表達率分別為24.28%(17/70)、35.71%(25/70)、22.85%(16/70)。癌組織中MTDH、NF-κB P65蛋白表達水平高于癌旁正常組織，癌組織中IκB蛋白表達水平低于癌旁正常組織，具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 MTDH、IκB、NF-κB P65蛋白表達與其臨床病理因素的關系

MTDH、IκB、NF-κB P65表達與乳腺癌臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤大小、病理類型以及ER、Her-2、Ki-67無顯著相關性(P>0.05)(表1)。

表1 MTDH、IκB、NF-κB P65蛋白表達與乳腺癌臨床病理指標的關系/例

3 討論

MTDH基因定位于人類8號染色體上(8q22)[7]。異黏蛋白是MTDH編碼的產物，它是由582個氨基酸組成的單跨膜蛋白，分子量約為64kD，等電點9.33[8]，肽鏈中富含賴氨酸和絲氨酸，對核定位功能發揮了關鍵作用[9]。文獻報道發現， MTDH可通過介導活化血管內皮生長因子促進腫瘤細胞中微血管的生成，促進腫瘤細胞增殖及遷移，并可以抑制腫瘤細胞的凋亡，提高惡性腫瘤的侵襲力[10]。MTDH的表達在體內通過多種信號傳導通路來促進腫瘤形成，目前比較明確的信號轉導途徑包括：PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路以及MAPK and Wnt信號通路[11]。在以往研究中，Hu等[12]的研究結果顯示大約44%～47%的原發乳腺癌中MTDH基因大量表達，并與臨床分期，腫瘤大小，淋巴結轉移，遠處轉移，預后較差等顯著相關。Su等[13]通過免疫組化的方法分析了MTDH在乳腺增生組織與乳腺癌組織中的表達，結果顯示癌組織的表達遠遠高于增生組織。本實驗應用實時熒光定量PCR及免疫組織化學法檢測MTDH在乳腺癌組織及癌旁正常組織中mRNA及蛋白質含量，發現癌組織中MTDH的表達高于癌旁正常組織，且表達與臨床分期、淋巴結轉移有關。從而提示MTDH表達的增高可能與乳腺癌的發生發展相關。

核轉錄因子是1類特殊的蛋白質，可以與一些基因啟動區中固定序列的核苷酸結合而啟動基因轉錄功能。NF-κB作為重要的轉錄激活因子，存在于各種生物的真核細胞中,它參與炎癥反應，同時也與腫瘤的形成有關[14]。IκB為NF-κB的抑制蛋白。NF-κB P65是NF-κB的1個亞單位，可直接作用于轉錄設備而激活基因轉錄，通常與P50形成二聚體而發揮廣泛的調節作用，它與細胞增殖及抗細胞凋亡有關，此外，在某些腫瘤生物行為比如組織侵襲與轉移方面也發揮著重要作用[15]。很多研究發現，IκB/NF-κB信號通路與多種癌癥的發生演變相關。Deepti等[16]對NF-κB P65與乳腺癌關系的研究證明NF-κB的異?；罨龠M腫瘤惡性生長。本實驗應用實時熒光定量PCR及免疫組織化學法檢測IκB、NF-κB P65在乳腺癌組織及癌旁正常組織中mRNA及蛋白質含量，發現癌組織中NF-κB P65表達水平高于癌旁正常組織，IκB表達水平低于癌旁正常組織，并且其表達與臨床分期、淋巴結轉移有關。從而提示NF-κB P65的表達增高和IκB的表達減低可能與乳腺癌的發生發展相關。IκB、NF-κB P65兩者在NF-κB/IκB信號通路中發揮了極其重要的作用。

綜上所述，本實驗通過測定乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達量，分析三者的表達與臨床病理學指標的相關性。證實了MTDH、IκB、NF-κB P65在乳腺癌發生發展中發揮著重要作用，為乳腺癌診治提供了重要的理論依據。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Significance of MTDH，IκB，NF-κB P65 in Breast Cancer Tissues

ZHANGShuowen,YANGWei,WANGXinle,etal.

TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,050000

Objective To observe the expression of MTDH,IκB,NF-κB P65 in the tissue of breast cancer and its correlation with clinical pathological indicators.Methods The expression of MTDH,IκB,NF-κB P65 of invasive breast cancer and peritumoral tissues were detected through real-time RT-PCR and immunohistochemical staining.Clinical and pathological significance of MTDH,IκB,NF-κB P65 were evaluated.Results The expression levels of MTDH,NF-κB P65 were higher in the breast cancer tissues than in peritumoral tissues (P<0.05).IκB expression level was lower in the breast cancer tissues than in peritumoral tissues (P<0.05).MTDH,IκB,NF-κB P65 expression were related to clinical TNM staging,and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion MTDH,IκB,NF-κB P65 expression may be related to breast cancer development.

Breast cancer;MTDH;IκB;NF-κB P65;Real-time RT-PCR;Immunohistochemistry

河北省自然科學基金(編號：H2012206169)

050000 河北醫科大學第一醫院(張碩穩)；050000 河北醫科大學第四醫院(楊 微，王新樂，宋 姮，宋振川)

宋振川

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.004

R737.9

A

1001-5930(2016)10-1578-04

2015-11-23

2016-05-19)