香椿老葉中黃酮與皂苷的含量測定

趙艷霞，劉常金，宛紅穎

（1.濟寧醫學院法醫學與醫學檢驗學院，山東濟寧272067；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院天津300457）

香椿老葉中黃酮與皂苷的含量測定

趙艷霞1，劉常金2，宛紅穎2

（1.濟寧醫學院法醫學與醫學檢驗學院，山東濟寧272067；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院天津300457）

以香椿老葉為材料，以乙醇為提取溶劑，對提取物中的黃酮和皂苷含量進行測定，使用HPLC方法對黃酮的種類進行了初步鑒定。結果表明，以質量分數計，香椿老葉中黃酮和皂苷的百分含量分別為（6.615±0.02）%和（3.917±0.05）%。HPLC結果表明，香椿老葉中的黃酮主要有3種，并含有1種非黃酮類的酚類物質，以質量分數計，4種化合物的百分含量分別為：蘆丁（1.55±0.01）%、槲皮素（2.27±0.05）%、山奈酚（1.31±0.01）%、沒食子酸（0.87±0.02）%。

香椿；黃酮；皂苷；酚類物質

香椿（Toona sinensis）是我國著名的傳統木本蔬菜，屬于楝科香椿屬多年生落葉喬木，其嫩芽具有獨特的香氣，富含多種營養素，深受廣大消費者喜愛。香椿的種子、根皮、葉片等部位可以作為中草藥進行配伍，具有多種醫療保健作用，含有多種生物活性成分。陳鐵山等對香椿種子、葉片中主要的化學成分以及種子揮發油進行了研究，結果發現香椿葉中含有黃酮、萜類、蒽醌、內酯、皂苷、鞣質、生物堿等重要藥用成分，種子含有醛、酮、萜類、皂苷、甾體、硫醇類化合物、多元醇類化合物、芳香族類化合物等［1］。劉忠良等運用GCMS分析了香椿籽油中的化學成分，分離并鑒定出39個組分，得到的主要化學成分為萜烯類（多為倍半萜類），其中含量較多的為反-石竹烯、白菖烯、γ-欖香烯、α-長蒎烯等［2］。程傳格等采用正己烷回流萃取得到香椿籽油并進行皂化-甲酯化，通過GC-MS方法鑒定出39種成分，包括22種為脂肪酸，占94.4%，其中亞油酸的含量最高達83.4%，其次是棕櫚酸和硬脂酸，17種為萜烯類化合物，占4.0%［3］。谷月玲等采用GCMS對同步蒸餾萃取得到的香椿葉精油進行了分析，共定性鑒定出55種化合物，其中含氧化合物38種，有酯14種、醇15種、醛和酮7種、含氮化合物2種，碳氫類化合物15種［4］。張仲平等發現香椿葉中含有豐富的小分子鞣質、原花色苷、黃酮醇苷、皂苷、有機酸等，利用薄層色譜分析（TLC）得到香椿葉經水解后的苷元主要是槲皮素、山萘酚；多酚中含黃酮類苷和苷元、沒食子酸、沒食子兒茶素縮合鞣質、沒食子鞣質、單體原花青素等成分，其中香椿葉中黃酮含量經過高效液相色譜法（HPLC）定量分析得出高于相同生長期的銀杏葉1倍多［5］。李秀信等對香椿果殼、果實部位黃酮類化合物進行了分析研究，結果表明，香椿果殼及果實中含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等多種黃酮類化合物［6］。由于產地不同和品種不同，香椿中的黃酮、酚類及皂苷等物質含量不同，對于中草藥的功效會產生一定的影響。王昌祿等對香椿的三萜皂苷含量進行了分析測定，發現香椿中皂苷的含量較高［7］。劉常金等對于不同季節和產地的香椿黃酮和皂苷進行了分析測定，發現不同產地和品種的香椿黃酮和皂苷存在明顯差異［8］。

本研究以山東省曲阜市產的香椿老葉為材料，測定了其中的黃酮與皂苷含量，并對黃酮的主要單體物質進行了初步鑒定，目的是為香椿功效成分研究和產品開發提供依據。

1　儀器及材料

1.1材料

香椿老葉2014年秋季采自山東省曲阜市香椿基地，采收后自然晾曬，干燥后粉碎成60目粉末，冰箱中保存。

1.2試劑

人參皂苷、蘆丁、沒食子酸、山奈酚標準對照品：均購自中國藥品生物制品研究所；氫氧化鈉：天津北方天醫試劑廠；高氯酸：天津北方天醫試劑廠；香草醛：上海靜融生物科技有限公司；乙醇：天津化學試劑一廠。

1.3試驗儀器

TE214S電子天平：賽多科斯科學儀器有限公司；SHB-3型循環水式多用真空泵、R-1001N旋轉蒸發儀：鄭州長城科工貿有限公司；HL-1S恒流泵、BS-100A自動部分收集器：上海瀘西分析儀器廠有限公司；Venusil MP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm）：天津博納艾杰爾科技有限公司；ZF-C型三用紫外分析儀：上海長明光學電子儀器廠；HPLC 2489型：WATERS公司。

2　試驗方法

2.1提取方法

將香椿老葉置于烘箱內（55℃）充分烘干24 h，將干燥后的香椿葉用粉碎機進行粉碎，然后過60目篩，香椿老葉粉在冰箱存放備用。

稱取1 kg香椿葉粉，采用事先優化的最佳提取工藝進行浸提，用15 L體積分數為60%的乙醇60℃水浴震蕩提取2 h后抽濾，濾渣加入15 L體積分數為60%的乙醇60℃再次水浴振蕩提取2 h，合并兩次提取液。用旋轉蒸發儀，減壓濃縮，得到香椿黃酮和皂苷的粗提液。

2.2總黃酮的測定

2.2.1蘆丁標準曲線的制作

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定總黃酮的含量，準確稱取蘆丁標準品100 mg，用體積分數為60%乙醇溶解，最后用體積分數為60%的乙醇定容至100 mL，裝入棕色瓶中置4℃冰箱保存備用。準確吸取1 mg/mL蘆丁標準溶液5 mL用體積分數為60%乙醇溶液定容至50 mL，搖勻得到質量濃度為100 μg/mL的蘆丁標準樣液，分別吸取0、12、15、18、21、24、27、30 mL于50 mL容量瓶，然后加入1.5 mL 5%NaNO2溶液后搖勻，6 min后加入1.5 mL質量分數為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min后加入10 mL質量分數為4% NaOH的溶液，混勻后用體積分數為60%乙醇定容到刻度，搖勻，15 min后，以第一支試管溶液為空白，在510 nm的條件下測定吸光值，以蘆丁添加量（mg）為橫坐標，以吸光值A作為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2.2提取液中總黃酮的含量測定

取香椿提取液過濾，將濾液置于容量瓶并定容至100 mL作為待測液，取1 mL待測液，按照標準曲線的方法測其吸光度。根據以下公式計算提取液中總黃酮的含量，計算公式：

式中：W為香椿老葉子中總黃酮的含量，mg/g；m1為由標準曲線換算得的總黃酮質量，mg；m2為稱取香椿老葉子的質量，g；V為添加待測提取液的體積，mL。

2.3總皂苷的測定

2.3.1人參皂苷標準曲線的制作

采用香草醛-冰乙酸比色法測定總皂苷含量。準確稱取人參皂苷20 mg，加入到10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，得到質量濃度為2 mg/mL的標準溶液，準確吸取標準溶液25、50、75、100、125 μL于刻度試管，揮發干溶劑，冷卻后加入質量分數為5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，再加入高氯酸0.8 mL，充分混勻，蓋塞后密封，60℃條件下水浴15 min，冷至室溫加冰乙酸5 mL，搖勻后于560 nm的條件下比色測定吸光值，以人參皂苷添加量（mg）為橫坐標，以吸光值A作為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.2提取液中總皂苷的含量測定

取香椿提取液過濾，將濾液置于容量瓶并定容至100 mL作為待測液，準確吸取待測液100 μL，按照標準曲線相同的測定方法測吸光度。根據以下公式計算提取液中總皂苷的含量，計算公式：

式中：W為香椿老葉子中總皂苷的含量，mg/g；m1為由標準曲線換算得的總皂苷質量，mg；m2為稱取香椿老葉子的質量，g；V為添加待測液的體積，mL。

2.4香椿中黃酮各組分的HPLC分析

2.4.1高效液相色譜條件

泵：二元梯度泵，流速為1.0 mL/min；色譜柱：C18柱（250 mm×5 mm，5 μm），柱溫40℃；流動相A：100%純甲醇；流動相B：0.1%磷酸水溶液；檢測波長：255nm。梯度洗脫的時間和洗脫液配比見表1。

表1　梯度洗脫的時間和洗脫液配比Table 1　Gradient elution and solution A and solution B ratio

2.4.2線性條件

精確稱取蘆丁對照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，用體積分數為80%甲醇溶解并定容至刻度，得到質量濃度為1.000 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

精確稱取沒食子酸對照品0.9700mg置于10mL容量瓶中，用體積分數為80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質量濃度為0.097 00 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

精確稱取槲皮素對照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質量濃度為1.000 mg/mL的槲皮素對照品溶液。

精確稱取山奈酚對照品1.020 mg置于10 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容到刻度，得到質量濃度為0.1020 mg/mL的山奈酚對照品溶液。

精確吸取上述配制好的蘆丁對照品溶液0.48 mL、沒食子酸對照品溶液2.8mL、槲皮素對照品溶液0.70mL、山奈酚對照品溶液2.1 mL于10 mL容量瓶中混勻，然后用體積分數為80%的甲醇溶液定容，得到混合標準品溶液。然后將混合標準品分別稀釋為1/8、2/8、4/8和6/8的混合標準溶液。準確按2.4.1的色譜條件，對配制好的不同濃度梯度的混合標準溶液進行分析測定，進樣量為10 μL，每個濃度測定5次取其平均值，以峰面積為縱坐標，各標準品的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程。

3　結果與分析

3.1香椿總黃酮與總皂苷的含量測定

3.1.1香椿總黃酮的含量測定

3.1.1.1蘆丁標準曲線的制作

以蘆丁為標準品，通過分光光度法制定黃酮標準曲線，以蘆丁的含量為（mg）橫坐標X，吸光度值（A）為縱坐標Y，繪制標準曲線。得到蘆丁添加量X與吸光度Y關系曲線的回歸方程為：y=0.254 7x+0.001 4，相關系數R2=0.999 4（如圖1），線性范圍為：0～3.0 mg。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　The standard curve of rutin reference

3.1.1.2提取液中總黃酮的含量

按照方法中的提取方法，對3份香椿老葉進行提取，分別測定3份香椿中黃酮的含量，每份平均測定3次，最后取其平均值，經過換算得到香椿老葉中總黃酮的百分含量為（6.615±0.02）%。

3.1.2香椿總皂苷的含量測定

3.1.2.1人參皂苷標準曲線的制作

以人參皂苷為標準品，采用香草醛法制定總皂苷測定的標準曲線，以人參皂苷的量為（mg）橫坐標x，吸光度值（A）為縱坐標y，繪制標準曲線。得到人參皂苷添加量X與吸光度值Y關系曲線的回歸方程為：y= 3.798 7x-0.012 6，相關系數R2=0.999 2（如圖2），線性范圍0～0.22 mg。

圖2　人參皂苷標準曲線Fig.2　The standard curve of ginsenoside reference

3.1.2.2提取液中總皂苷的含量

按照與黃酮提取相同的方法分別處理3份香椿老葉，分別測定3份香椿中總皂苷的含量，每份平均測定3次，最后取其平均值，經過換算得到香椿干葉中總皂苷的百分含量為（3.917±0.05）%。

3.2香椿黃酮中的各組分的高效液相色譜分析

3.2.1香椿黃酮中的各組分的液相色譜圖

采用蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒食子酸為標準品進行HPLC分析，同時分析香椿提取液及酸解后的主要黃酮苷元和酚類物質，結果如圖3所示。

圖3　蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒食子酸標準品的HPLC圖譜Fig.3　HPLC graph of standard including rutin，quercetin，kaempferol and gallic acid

3.2.2精密度試驗

圖4　香椿提取液酸解前的HPLC圖譜Fig.4　HPLC graph of TS extract before acid hydrolysis

圖5　香椿提取液酸解后的HPLC圖譜Fig.5　HPLC graph of TS extract after acid hydrolysis

蘆丁、沒食子酸、槲皮素、山奈酚的質量濃度分別為48、27、70、21 μg/mL的混合標準品溶液重復進樣5次，根據各標準品的峰面積，計算相應的RSD值分別為：0.313%、0.92%、0.316%、1.013%，結果表明儀器精密度良好。

3.2.3穩定性試驗

蘆丁、沒食子酸、槲皮素、山奈酚質量濃度分別為48、27、70、21 μg/mL的混合標準品溶液在配制0、2、4、8、10、24 h后分別重復進樣5次，根據各標準品的峰面積，計算相應的RSD值分別為：0.34%、1.125%、0.335%、1.176%，結果表明，供試樣品溶液在24小時內穩定。

3.2.4香椿提取液中黃酮各組分的含量測定

提取液樣品中蘆丁、沒食子酸、槲皮素、山奈酚的含量的測定結果見表2。

表2　香椿老葉中主要酚類物質含量Table 2　The main phenolics of TS old leaves

4　結論

1）利用酒精浸提法，料液比為1∶15（kg/L），60℃振蕩提取2 h后得到香椿的粗提取液。以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定得到香椿老葉中總黃酮的百分含量為（6.615±0.02）%；以人參皂苷為標準品，采用香草醛-冰醋酸的方法測定得到香椿干葉中總皂苷的百分含量為（3.917±0.05）%。

2）通過對香椿提取液中各組分HPLC分析，得出香椿提取物中蘆丁、槲皮素、山奈酚、沒食子酸的百分含量分別為（1.55±0.01）%、（2.27±0.05）%、（1.31±0.01）%、（0.87±0.02）%。

本研究表明，曲阜生產的香椿老葉中含有豐富的抗氧化活性物質黃酮、酚類物質及皂苷等，適合作為生產抗氧化天然產物的提取原料，為開發保健品和天然抗氧化劑提供物質基礎。

［1］陳鐵山，羅忠萍，崔宏安，等．香椿化學成分的初步研究［J］．陜西林業科技，2000（2）：1－2

［2］劉忠良，馬天波，孫立明.香椿籽揮發油的GC－MS［J］．中國藥學雜志，2002，37（2）：94－96

［3］程傳格，王曉，江婷，等．香椿籽油成分的GC－MS分析［J］．分析測試學報，2001，20（4）：74－76

［4］谷月玲，胡耿源，傅水玉．香椿葉精油成分的研究（2）香椿葉精油的GC/MS定性分析［J］．質譜學報，1994，17（4）：57－59

［5］張仲平，孫英，牛超，等．香椿多酚類化介物的提取、分離和薄層研究［J］．中國野生植物資源，2002，21（4）：52－53

［6］李秀信，張院民，劉青利，等．香椿葉中黃酮成分的分析鑒定［J］．西北林學院學報，2001，16（增）：86－88

［7］王昌祿，欒穎，陳志強，等．薄層分離－分光光度法測定楝科植物中三萜皂苷含量［J］．安徽農業科學，2008，36（14）：5708－5712

［8］劉常金，江慎華，王昌祿，等.不同季節與產地香椿黃酮與皂苷的含量變化［J］.天津科技大學學報，2006，21（1）：18-20

Determination of Flavonoids and Saponins in Old Leaves of Toona sinensis

ZHAO Yan-xia1，LIU Chang-jin2，WAN Hong-ying2
（1.Institute of Forensic Medicine and Laboratory Medicine，Jining Medical University，Jining 272067，Shandong，China；2.School of Food Science and Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The contents of flavonoids and saponins in Toona sinensis（TS）old leaves were determined with alcoholic solution as extracting solvents，and the detailed components of flavonoids of TS were analyzed with HPLC method.The results showed that the percentage contents of flavonoids and saponins in TS old leaves amounted to（6.615±0.02）%and（3.917±0.05）%，respectively.There were three kinds of flavonoids and one polyphenols in extracts with HPLC analysis，and the content was as following，rutin（1.55±0.01）%，quercetin（2.27±0.05）%and kaempferol（1.31±0.01）%，gallic acid（0.87±0.02）%，respectively.

Toona sinensis；flavonoids；saponins；phenolics

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.031

趙艷霞（1969—），女（漢），高級實驗師，碩士，研究方向：天然產物化學。

2015-12-14