金釵石斛多糖提取工藝研究

余芳，鄭萍，哈清，汪洪濤，蔣彩云

（江蘇經貿職業技術學院食品系，江蘇省食品安全工程技術研究開發中心，江蘇南京211168）

金釵石斛多糖提取工藝研究

余芳，鄭萍，哈清，汪洪濤，蔣彩云

（江蘇經貿職業技術學院食品系，江蘇省食品安全工程技術研究開發中心，江蘇南京211168）

以金釵石斛為原料，經粉碎、脫脂、打漿和超聲波破壁等處理后采取水提取法，通過單因素和正交試驗試驗，研究了水提溫度、超聲波時間、水提時間、料液比對超聲輔助提取金釵石斛中多糖的影響。結果表明，影響金釵石斛多糖提取因素的主次關系為：料液比>超聲波時間>水提溫度>水提時間，金釵石斛多糖提取的最佳條件為：料液比1∶25（g/mL）、超聲波時間40min、水提時間120min、水提溫度80℃。

金釵石斛；多糖；超聲輔助提取；正交試驗

金釵石斛是《中國藥典》收載的5種石斛之一，為我國傳統名貴中藥，《本草綱目》中記載其“強陰益精，厚腸胃，壯筋骨，暖水臟，補腎益力，輕身延年”，用于治療熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱、目暗不明等癥，具有較高的藥用價值。金釵石斛的主要藥用成分是石斛堿和多糖［1］，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗菌［2-5］等多種功效。傳統經驗認為，質重、嚼之粘牙、味甘、無渣者為優品，其多糖含量較高［6］。本文研究了金釵石斛多糖的提取優化工藝，旨在為金釵石斛資源開發利用提供參考。

金釵石斛多糖的提取方法有很多，目前常用的提取方法有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、水提醇沉多糖和酶法。水提法是提取多糖的最常用方法之一，使用較多的是熱水浸提。超聲提輔助取法主要是利用超聲波破壞植物細胞組織，使之變形、破裂并釋放出內含物，同時加速植物有效成分在溶劑中的擴散釋放，促進植物有效成分與溶劑混合，有利于萃取。葉余原等［7-9］進行了超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究，考察了提取溫度、固液比、提取時間和超聲頻率4個因素對鐵皮石斛多糖提取率的影響。在單因素實驗的基礎上，通過正交試驗優化提取工藝，綜合確定的優化提取工藝條件為1∶30（g/mL）的料液比，超聲波功率300 W，45 kHz超聲頻率，提取1.5 h，鐵皮石斛多糖的平均得率為15.3%，鄭斯卓等［10］選定提取溫度、提取次數和乙醇最終濃度三個因素研究其對金釵石斛多糖提取率的影響。得到多糖浸提的最佳工藝條件為提取溫度為85℃，提取次數為3次，乙醇終濃度為75%。劉文等［11］在單因素試驗基礎上，以微波頻率、料液比、浸提時間、微波時間為正交試驗的影響因素，以多糖的提取率為評價指標，對影響石斛多糖提取工藝的因素進行研究。最佳實驗條件是為：微波頻率為1 470 MHz，料液比1∶30（g/mL），浸提時間3 h微波時間10 min。在此條件下，金釵石斛粗多糖得率為4.23%。

我國藥用植物資源十分豐富，是藥物研發的源泉［12］。近幾年來，金釵石斛多糖以其獨特的作用成為近年來研究的重點。因此，開展金釵石斛多糖的提取分離純化工藝研究，為多糖的醫療保健功能開發提供理論依據。目前，金釵石斛多糖分離純化還處于小批量實驗室階段，而規模化的提取、精制、純化及其應用開發等都需要深入的研究。

1　材料與方法

1.1材料及試劑

金釵石斛：產自貴州遵義。

濃硫酸、苯酚、石油醚、無水乙醇、三氯乙酸、葡萄糖等試劑皆為國產分析純。

1.2儀器及設備

KJ-TBL-5A低速臺式大容量離心機：無錫市瑞江分析儀器有限公司；JY98-ШDN超聲波細胞粉碎機：寧波超聲波設備有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；SZ-1型快速混勻器：江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；722S可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；DGF30/23-ⅢA型電熱鼓風干燥箱：南京實驗儀器廠；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE-5203旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1標準曲線制作

稱取105℃干燥至恒重的標準葡萄糖100.0 mg，置100 mL容量瓶中，加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 mL，置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，每毫升含葡萄糖0.1 mg。分別精密取溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，置于具塞試管中，分別加水至2.0mL，各加入5%苯酚溶液1.0mL搖勻，迅速加入硫酸5.0 mL搖勻，放置10 min，置沸水浴中加熱15 min，取出迅速冷卻至室溫，紫外分光光度計490 nm波長處測定吸光度，空白對照以2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖溶液。以吸光度（X）為橫坐標、濃度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2金釵石斛粗多糖制備

新鮮的金釵石斛洗凈→粉碎→脫脂→打漿→超聲波細胞粉碎→超聲輔助提取→熱水浸提→冷卻→離心→取上清液（苯酚-硫酸法測定多糖含量）→上清液真空濃縮至1/3→加入3%的三氯乙酸溶液→搖勻→靜置→離心→得蛋白沉淀和多糖溶液→多糖溶液→加無水乙醇→搖勻→靜置→離心→烘干沉淀→金釵石斛多糖

1.3.3金釵石斛中多糖提取單因素試驗

準確稱取金釵石斛粉末2 g，加水打漿后超聲破壁處理2 min（作用時間2 s，間歇時間3 s）。通過單因素試驗，考察超聲波時間、水提溫度、水提時間、料液比對金釵石斛多糖含量的影響，采用苯酚-硫酸法［13］測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.1水提溫度

設定水提溫度50、60、70、80、90℃，超聲波功率200 W，浸提120 min，料液比1∶30（g/mL），超聲波時間40 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.2水提時間

按照料液比1∶30（g/mL），超聲波功率200 W，溫度60℃，超聲波時間40 min，浸提時間設定90、120、150、180、210 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.3超聲波時間

設定超聲波時間20、30、40、50、60 min，料液比1∶30（g/mL），超聲波功率200 W，溫度為60℃，浸提120 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.3.4料液比

按照料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），超聲波時間40 min，超聲波功率200 W，溫度60℃，浸提120 min，測定金釵石斛多糖含量。

1.3.4金釵石斛多糖提取工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以料液比、超聲波時間、水提時間及水提溫度作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗。采用L9（34）正交表進行正交試驗設計，來確定提取最佳工藝。

表1　金釵石斛多糖提取因素水平表Table 1　Levels and factors of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction

2　結果與分析

2.1葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Glucose standard curve

葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=0.340 6x-0.002 2（x為葡萄糖濃度，y為吸光度），線性相關系數為：R2= 0.999 1。金釵石斛多糖溶液在此濃度范圍內，與吸光度呈良好的線性關系。當測定多糖含量時，將所測定得到的吸光度代入葡萄糖標準曲線回歸方程，即能夠計算出所測溶液的多糖含量。

2.2提取條件對得率的影響

2.2.1超聲提取時間對得率的影響

超聲提取時間對得率的影響見圖2。

圖2　超聲提取時間對多糖含量的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on polysaccharides content

由圖2可知，使用超聲波進行輔助提取與未使用相比，多糖含量明顯提高；隨著超聲時間的增加，多糖含量呈先上升后平穩趨勢。超聲時間在30 min至50 min范圍內，多糖含量較為穩定，當超聲時間為40 min時，多糖含量最高，達到最大值。李金忠等［14］對超聲輔助提取山藥多糖進行研究，該工藝與傳統水提法工藝相比，山藥多糖得率提高了2倍多，同時大大縮短了提取時間。

2.2.2水提溫度對得率的影響

水提溫度對得率的影響見圖3。

圖3　水提溫度對得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides content

圖3的結果表明，在50℃至80℃范圍內，金釵石斛多糖的得率隨著溫度的升高呈現上升趨勢，得率不斷增大。這是因為溶液的溶解度隨著溫度增加不斷增大。在80℃之后，金釵石斛多糖的得率隨著溫度的升高呈下降趨勢，得率不斷降低，因而選擇70、80、90℃作為正交試驗的3個試驗水平。

2.2.3水提時間對得率的影響

水提時間對得率的影響見圖4。

圖4　水提時間對得率的影響Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides content

由圖4可知，超聲輔助提取后水提時間在前90 min～150 min內，隨著提取時間的延長，金釵石斛中多糖的得率隨之升高，150 min末接近最大值，可見反應時間越長，提取越充分。在150 min～210 min，金釵石斛多糖得率下降。因此，選擇水提時間120、150、180 min作為正交試驗的3個水平。

2.2.4料液比對得率的影響

料液比對得率的影響見圖5。

圖5　料液比對得率的影響Fig.5　Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides content

由圖5的結果可知，料液比由1∶20（g/mL）到1∶30（g/mL），多糖得率逐漸增大。當料液比為1∶30（g/ mL）時得率達到5.913%，之后，隨著液體的增多，多糖得率也逐步下降。料液比為1∶40（g/mL）時，多糖得率為4.445%。因此，選擇1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）作為正交試驗的3個水平。

2.3正交試驗

正交試驗結果見表2。

表2　正交試驗結果Table 2　Result of the orthogonal experiment

續表2 正交試驗結果Continue table 2　Result of the orthogonal experiment

根據單因素試驗的結果，選取影響金釵石斛多糖提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗，對結果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9（34）正交表，以超聲波時間（A）、水提溫度（B）、水提時間（C）、料液比（D）作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗。每一水平K1、K2、K3中最大的值所對應的條件即為該因素對應的最佳提取條件。由表2可以看出提取金釵石斛多糖的最佳條件為A2B2C1D1，即超聲波輔助提取后水提溫度80℃、超聲波時間40 min、超聲波輔助提取后水提時間120 min、料液比1∶25（g/mL）。4個因素對金釵石斛多糖得率的影響大小依次為：D>A>B> C，其中料液比D的提取作用最為顯著。利用最佳的提取條件，進行重復試驗可使多糖平均得率達到6.945%。

3　結論

采用超聲波輔助水浸提金釵石斛多糖，通過單因素試驗和正交試驗結果分析可得出金釵石斛多糖提取最優工藝：超聲波時間40 min，水提時間120 min，水提溫度80℃，料液比1∶25（g/mL）。

利用超聲輔助提取方法，極大程度地縮短了水提時間，并且得到了較高的得率。利用最佳的提取條件，進行重復試驗可使多糖平均得率達到6.945%。

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Study on the Extraction of Dendrobium nobile Lindl Polysaccharide

YU Fang，ZHENG Ping，HA Qing，WANG Hong-tao，JIANG Cai-yun
（College of Food，Jiangsu Institute of Economic＆Trade Technology，Research and Development Center of Food Safety Engineering Technology，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

Dendrobium nobile Lindl was used as raw material after crushing，degreasing，beating，ultrasonic wall-breaking and extracted in water，the effects of Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction on single factor as water extraction temperature，ultrasonic time，water extraction time and solid-liquid ratio on ultrasonic assisted extraction were studied.By orthogonal test，the analysis influences Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction of primary and secondary relations of factors were as follows：material liquid ratio> ultrasonic time>water extraction temperature>water extraction time.The results showed that the best conditions for：material liquid ratio 1∶25（g/mL），ultrasonic time 40 min，water extraction time 120 min and water extraction temperature 80℃，and the influence of material liquid ratio on Dendrobium nobile Lindl polysaccharide extraction yield was the most significant.

Dendrobium nobile Lindl；polysaccharide；ultrasonic assisted extraction；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.011

江蘇省青藍工程資助，江蘇經貿職業技術學院院級課題（JSJM1410）

余芳（1970—），女（漢），教授，博士，研究方向：食品營養與安全。

2015-12-24