木奶果花色苷提取純化及其抗氧化活性研究

鄧浩，張容鵠，*，梁振益，馮建成，竇志浩，晁增燕

（1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所，海南海口570100；2.海南大學材料與化工學院，海南海口570100）

木奶果花色苷提取純化及其抗氧化活性研究

鄧浩1，張容鵠1，*，梁振益2，馮建成2，竇志浩1，晁增燕2

（1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所，海南海口570100；2.海南大學材料與化工學院，海南海口570100）

采用溶劑提取法提取木奶果果肉中的花色苷，得到最佳提取工藝條件為：提取溶劑為用1%HCl酸化過的乙醇溶液，溶劑濃度為60%，料液比為1∶20（g/mL），提取時間為45 min，提取溫度為50℃；采用大孔樹脂法分離和純化提取物中的花色苷，5種大孔樹脂靜態吸附率大小順序為：AB-8（92.80%）＞D101（91.90%）＞NKA-Ⅱ（90.80%）＞X-S（90.50%）＞D-151（88.20%）＞D-280（83.40%）；選用D-101和AB-8兩種對花色苷吸附率較高的樹脂進行解吸率實驗，選擇乙醇為洗脫液，當乙醇濃度為60%時，D-101和AB-8的洗脫率分別為82.06%和84.32%；采用DPPH自由基法測定木奶果中花色苷的抗氧化活性，當花色苷的濃度為5.70 μg/mL時，自由基清除率最高達到90.00%，IC50為3.35 μg/mL，表現為較強的抗氧化活性。

木奶果；花色苷；提取；抗氧化活性

木奶果（Baccaurea ramiflora Lour），別名也稱為水賴、麥穗、蒜瓣果，屬大戟科木奶果屬植物，為常綠喬木或灌木，生于低海拔至中海拔的山谷、山坡陰濕林中，是熱帶雨林植物代表種類之一。本屬約有80余種，分布于印度、馬來西亞、緬甸、泰國、越南、老撾、柬埔寨、中國、印度尼西亞等國［1-2］。我國有3種，主要分布于海南、云南等。其果肉含人體所需的營養成分，根、果皮均可入藥［3］。20世紀90年代初，胡建香等［4］對西雙版納地區野生木奶果果實進行了成分分析，其果實可食率為49.2%，含水分84.7%、脂肪為0.06%、淀粉為0.47%、纖維為0.29%、維生素C為1.57 mg/100 g、可滴定酸為1.99%、總糖為11.87%，目前針對木奶果果實的功能成分的研究報道較少。

花青素是一類天然的可食用的水溶性色素［5］，屬酚類化合物中的類黃酮，其色澤鮮亮自然、無毒、無特殊氣味，具有抗炎抗氧化［6］、保肝［7-8］、護腎［9］、控制血糖［10］等功能，在食品、化妝品及醫藥等行業中有廣闊的應用前景。開展木奶果中花青素的提取工藝及其抗氧化活性的研究，對進一步掌握木奶果的功能成分及功效，對食品加工業天然色素的開發與利用都具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

木奶果：購于海南省保亭縣南林鄉，2014年6月15日于海南保亭南林鄉采摘后低溫運到實驗室，果皮、果肉分離后，于-50℃冷凍后經真空冷凍干燥保存備用；甲醇、乙醇、鹽酸、氯化鉀、醋酸、醋酸鈉等試劑：均為國產分析純；大孔吸附樹脂AB-8、D-101、D-151、D-280、NKA-Ⅱ、X-S：阿拉丁試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計：日本島津公司；HHS-4S水浴鍋：上海市南陽儀器有限公司；旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；CPA225D電子分析天平：德國Sartorius公司。

1.3試驗方法

1.3.1花色苷的提取

1.3.1.1緩沖溶液的配制、花色苷的測定

參照宋德群等［11］的方法配制緩沖溶液。pH 1.0緩沖液：將0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl以25∶67（體積比）的比例配制；pH 4.5緩沖液：將0.1 mol/L NaAc、0.1 mol/L HCl與H2O以100∶60∶90（體積比）的比例配制。

參照戚向陽等［12］的pH示差法檢測花色苷。分別取0.025 mol/L氯化鉀緩沖液（pH1.0）和0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）各9 mL。分別加入待測樣品1 mL，混勻，平衡1 h，用蒸餾水作空白，在最大吸收波長處的吸光值Aλvis-max和校正渾濁度處A700nm測定稀釋樣品的吸光度。A＝（Aλvis-max－A700）pH1.0－（Aλvis-max－A700）pH4.5，原始樣品中花色苷色素含量：m/（mg/L）=（A×MW×DF×1000）/（ξ× 1），式中：MW為相對分子質量；DF為稀釋因子；ξ為摩爾吸光度；1為比色皿直徑（1 cm）。本研究中按矢車菊-3-葡萄糖苷計算花色苷濃度，其MW＝449.2，DF= 10，ξ＝26900。

1.3.1.2提取溶劑種類、濃度的選擇

分別稱取果肉1.0 g 6份，標記為A1、A2、A3、A4、A5、A6，分別加入蒸餾水、1%HCl酸化過的蒸餾水、乙醇、1%HCl酸化過的乙醇、甲醇、1%HCl酸化過的甲醇6種提取溶劑，料液比1∶20（g/mL），于水浴鍋40℃的條件下提取2次，每次30 min，合并2次提取液，定容至50 mL。提取的花色苷按1.3.1.1方法檢測。

分別稱取果肉1.0 g 5份，標記為B1、B2、B3、B4、B5，按上一步驟實驗得出的最佳提取液以濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%比例加入，料液比1∶20（g/mL），于水浴鍋40℃條件下攪拌提取2次，每次30 min，合并2次提取液，定容至50 mL。提取的花色苷按1.3.1.1方法檢測。

1.3.1.3料液比、提取時間、提取溫度的選擇

分別稱取果肉1.0 g 6份，標記為C1、C2、C3、C4、C5、C6，按以上步驟選擇出的最適合的溶劑及其最佳濃度，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），于水浴鍋40℃條件下提取2次，每次30 min，合并2次提取液，定容至50 mL。提取的花色苷按1.3.1.1方法檢測。

分別稱取果肉1.0 g 5份，標記為D1、D2、D3、D4、D5，按以上3個步驟得出的最佳溶劑、溶劑濃度、料液比等參數，于水浴鍋40℃條件下提取2次，每次的時間分別為15、30、45、60、120 min。合并2次提取液，定容至50 mL。提取的花色苷按1.3.1.1方法檢測。

分別稱取果肉1.0 g 6份，標記為E1、E2、E3、E4、E5、E6，按以上4個步驟得出的最佳溶劑、溶劑濃度、料液比、提取時間等參數分別于30、40、50、60、70℃的條件下水浴提取2次，合并2次提取液，定容至50 mL。提取的花色苷按1.3.1.1方法檢測。

1.3.2花色苷的純化

1.3.2.1大孔吸附樹脂種類的選擇

分別稱取已處理好的大孔吸附樹脂AB-8、D-101、D-151、D-280、NKA-Ⅱ、X-S各5 g于燒杯中，標記為1～6，各加入10 mL樣液，放置，靜態吸附24 h后測其在最大吸收波長處的吸光值。吸附量Q=（C0－Ce）× V/m。式中：Q為吸附量，mg/g；C0為起始質量濃度，mg/ mL；Ce為平衡質量濃度，mg/mL；V為吸附液體積，mL；m為樹脂質量，g。

1.3.2.2洗脫液濃度的選擇

選取上一步驟中吸附量較好的2種大孔吸附樹脂，分別用0%、20%、40%、60%、80%的乙醇溶液25 mL進行洗脫3次，以解析率為衡量指標，確定最佳洗脫液濃度。解析率測定公式：D/%=Cd×Vd×100/［（C0－Ce）×V］。式中：D為解吸率，%；Cd為解吸液質量濃度，mg/mL，Vd為解吸液體積，mL。

1.3.3花色苷的抗氧化活性的測定

參照Bao J［13］等DPPH自由基法測定花色苷的抗氧化活性。將樹脂分離的樣品用蒸餾水稀釋至不同的濃度，分別取樣品2 mL和2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫下避光反應30 min，在517 nm下測定吸光值Ai；Aj為2 mL無水乙醇加2 mL樣品溶液的吸光度，A0為2 mL DPPH加2 mL蒸餾水的吸光度，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調零。平行測定3次取平均值，清除率按下式計算：清除率/%=1-［（Ai-Aj）/A0］×100。

2　結果與分析

2.1花色苷的提取

2.1.1提取溶劑種類、濃度的選擇

選擇不同的溶劑對木奶果中的花色苷進行提取。A1，A2，A3，A4，A5，A6，分別代表的溶劑是蒸餾水、1% HCl酸化過的蒸餾水、乙醇、1%HCl酸化過的乙醇、甲醇和1%HCl酸化過的甲醇。結果如圖1所示。

圖1　溶劑種類對花色苷質量分數的影響Fig.1　Effect of solvent types on the content of anthocyanin

由圖1可知，花色苷通過有機溶劑和水的提取差別不大，酸化過的溶液比沒酸化過的提取效果明顯要好，這可能是因為花色苷是酚類化合物，在偏酸性有機溶劑中有更大的溶解度。因此選擇1%HCl酸化過的乙醇作為提取劑。

選擇不同的乙醇濃度對木奶果花色苷進行提取，結果如圖2所示。

由圖2可知，當乙醇濃度小于60%（體積比）時，隨著乙醇濃度增加提取的花色苷質量分數不斷增加，當乙醇濃度60%時，提取的花色苷質量分數達到最大值0.135 mg/g。當乙醇濃度大于60%時，隨著乙醇濃度增加提取的花色苷質量分數不斷減少，可能是因為在乙醇濃度為60%時的極性與花色苷提取物的極性相近，根據相似相溶原理，此時溶解度最大，便于提取。因此選擇提取溶劑為1%HCl酸化過濃度為60%的乙醇。

圖2　溶劑濃度對花色苷質量分數的影響Fig.2　Effect of solvent concentration on the content of anthocyanin

2.1.2料液比、提取時間、提取溫度的選擇

選擇不同的料液比對木奶果花色苷進行提取，結果如圖3所示。

圖3　料液比對花色苷質量分數的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the content of anthocyanin

由圖3可知，隨著料液比的減小，提取的花色苷質量分數呈上升趨勢，當料液比達到1∶20（g/mL）時，花色苷質量分數達到最大值0.138 mg/g，繼續減少料液比對花色苷提取效果影響不大，因此選擇料液比為1∶20（g/mL）。

選擇不同的提取時間對木奶果花色苷進行提取，結果如圖4所示。

由圖4可知，提取時間為45 min時提取的花色苷質量分數達到最大值0.140 mg/g，之后提取時間越長提取量反而越來越少，可能是提取時間過長花色苷被氧化造成的，因此選擇提取時間為45 min。

選擇不同的提取溫度對木奶果花色苷進行提取，結果如圖5所示。

由圖5可知，提取溫度為50℃時提取的花色苷質量分數達到最大值0.182 mg/g，之后隨著提取溫度的增加花色苷的提取質量分數反而越來越少，可能是花色苷在高溫下被氧化分解造成的，因此選擇提取溫度為50℃。

圖4　提取時間對花色苷質量分數的影響Fig.4　Effect of time on the content of anthocyanin

圖5　溫度對花色苷質量分數的影響Fig.5　Effect of temperature on the content of anthocyanin

2.2花色苷的純化

2.2.1大孔吸附樹脂種類的選擇

采用大孔樹脂法分離和純化木奶果提取物中的花色苷，對比了5種大孔樹脂靜態吸附情況，結果如圖6所示。

圖6　樹脂的種類對花色苷吸附率的影響Fig.6　Effect of macroporous resin types on the adsorption rate of anthocyanin

由圖6可知，吸附率大小順序為：AB-8（92.80%）＞D101（91.90%）＞NKA-Ⅱ（90.80%）＞X-S（90.50%）＞D-151（88.20%）＞D-280（83.40%）＞。因此選擇大孔吸附樹脂種類為AB-8和D101。

2.2.2洗脫液濃度的選擇

選用D101和AB-8兩種吸附率較高的大孔吸附樹脂進行靜態解吸實驗，以不同濃度的乙醇溶液為洗脫液，結果如圖7所示。

圖7　洗脫液濃度對花色苷洗脫率的影響Fig.7　Effect of concentration of elution solution on the elution rate of anthocyanins

由圖7可知，隨著洗脫液濃度的增加，兩種大孔吸附樹脂的洗脫率的逐漸增大，當洗脫液濃度達到60%（體積比）以后，洗脫率維持基本不變。因此，選擇脫液濃度為60%。

2.3花色苷的抗氧化活性的測定

DPPH分子溶液具有典型紫色，在517 nm處有強吸收，當它與自由基清除劑作用時，生成無色產物，溶液的紫色變淺［14］。結果如圖8所示。

圖8　花色苷濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.8　Effect of concentration ofanthocyanin on the rate of scavenging DPPH radical

由圖8可知，木奶果的花色苷提取物對DPPH自由基有一定的清除能力，且隨質量濃度的增加而增強。當提取物的濃度為5.70 mg/mL時，自由基清除率達到90.00%，IC50為3.35 μg/mL。一般認為某種物質清除自由基的IC50值低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性［15］。可見木奶果中花色苷提取物有較強的抗氧化活性。

3　結論

采用溶劑提取法提取木奶果果肉中的花色苷，研究了提取溶劑、溶劑濃度、料液比、提取時間和提取溫度對提取效果的影響，得最佳提取工藝條件為：提取溶劑為用1%HCl酸化過的乙醇溶液、溶劑濃度為60%、料液比為1∶20（g/mL）、提取時間為45 min和提取溫度為50℃。

采用大孔樹脂法分離和純化木奶果提取物中的花色苷，對比了5種大孔樹脂靜態吸附及解吸結果，吸附率大小順序為：AB-8（92.80%）＞D101（91.90%）＞NKA-Ⅱ（90.80%）＞X-S（90.50%）＞D-151（88.20%）＞D-280（83.40%）；選用D101和AB-8兩種吸附率較高的樹脂進行解吸率實驗，選用乙醇為洗脫液，當乙醇濃度為60%時，D101和AB-8的洗脫率分別為82.06%和84.32%。

采用DPPH自由基法測定木奶果花色苷提取物的抗氧化活性，當提取物的濃度為5.70 μg/mL時，自由基清除率最高達到90.00%，IC50為3.35 μg/mL，表現為較強的抗氧化活性。

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Study on the Extraction and Purification of Anthocyanins from Baccaurea ramiflora Lour and Its Antioxidant Activity

DENG Hao1，ZHANG Rong-hu1，*，LIANG Zhen-yi2，FENG Jian-cheng2，DOU Zhi-hao1，CHAO Zeng-yan2
（1.Institute of Processing&Design of Agroproducts，Hainan Academy of Agricultural Science，Haikou 570100，Hainan，China；2.College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570100，Hainan，China）

The anthocyanins from Baccaurea ramiflora Lour fruit flesh were extracted by solvent method，the optimal extraction conditions were：extraction solvent was ethanol solution with 1%HCl，solvent concentration was 60%，solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL），extraction time was 45 min，extraction temperature was 50℃；five different macroporous resins were used to separate and purify the anthocyanins in the extract，and the static adsorption rates order was：AB-8（92.80%）＞D101（91.90%）＞NKA-Ⅱ（90.80%）＞X-S（90.50%）＞D-151（88.20%）＞D-280（83.40%）.The elution rates of AB-8 and D-101 were 82.06%and 84.32%when the concentration of ethanol was 60%.The antioxidant activity of anthocyanins from Baccaurea ramiflora Lour was determined by DPPH radical scavenging method，when the anthocyanin concentration was 5.70 μg/mL，the free radical scavenging rate was 90%，IC50was 3.35 μg/mL，showed strong antioxidant activity.

Baccaurea ramiflora Lour；anthocyanin；extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.008

海南省自然科學基金項目（314156）

鄧浩（1987—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：農產品加工。

2015-12-22