蜂膠及其提取物對3T3-L1前脂肪細胞增殖的作用

王月華，付崇羅，張麗，玄紅專

（聊城大學生命科學學院，山東聊城252059）

蜂膠及其提取物對3T3-L1前脂肪細胞增殖的作用

王月華，付崇羅，張麗，玄紅專*

（聊城大學生命科學學院，山東聊城252059）

研究巴西蜂膠、中國蜂膠乙醇提取物，中國蜂膠乙酸乙酯及水提取物以及蜂膠中主要組分短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對3T3-L1前脂肪細胞的影響。采用正常培養的3T3-L1前脂肪細胞經不同濃度、不同提取方法得到的蜂膠及其主要組分分別處理24 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態，SRB法檢測細胞存活率。蜂膠及其各種提取物抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖效果各不相同，中國蜂膠、中國蜂膠乙酸乙酯提取物、咖啡酸苯乙酯抑制增殖尤為明顯。蜂膠及其主要組分抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖。

蜂膠；中國蜂膠乙酸乙酯提取物；中國蜂膠水提物；3T3-L1細胞

蜂膠是西方蜜蜂從植物的樹芽、樹皮等部位采集的樹脂并混入其上顎腺、蠟腺的分泌物加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。根據蜂膠的植物來源，把世界不同地區的蜂膠大致分為六類，分別是：楊樹型蜂膠、樺樹型蜂膠、巴西綠膠、紅膠、太平洋蜂膠以及加那利群島蜂膠。盡管不同地區蜂膠化學成分相差很大，但目前研究表明，不同地區的蜂膠具有相似的生物學活性，如保肝［1］、抗菌［2-3］、抗炎［4］、抗腫瘤［5-7］、降血脂［8］、抑制血小板凝集［9］等，因而目前蜂膠廣泛應用于保健品、食品及藥品，用于增進健康，預防疾?。?0］。

中國蜂膠屬于楊樹型蜂膠，其主要成分為酚酸類和黃酮類化合物。蜂膠難溶于水，易溶于有機溶劑。目前蜂膠研究主要以蜂膠的乙醇提取物，乙酸乙酯提取物以及水提取物為主，但是基于不同提取方法所得到的蜂膠提取物之間活性的比較研究較少，而且蜂膠是一種復合物，蜂膠里面至少含有300種以上的化學成分，目前關于蜂膠中功效成分的研究還較少。我們前期體內外試驗均表明，蜂膠具有較好的降血脂功效［11-12］，但蜂膠降血脂，調節脂質異常的機理還不清楚，基于此，本試驗通過比較中國蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物、中國蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物以及蜂膠中主要組分如咖啡酸苯乙酯、咖啡酸芐酯、短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對3T3-L1前脂肪細胞增殖的作用，初步研究蜂膠及其主要組分對前脂肪細胞的作用。

1　材料和方法

1.1材料

DMEM培養基：美國Gibco公司；胎牛血清：美國Hyclone公司；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）：美國Sigma公司；細胞培養皿、96孔板：美國Falcon公司；Tris：上海生工；其它試劑均為分析純。

中國蜂膠采自山東省，主要植物來源為白楊屬。巴西蜂膠為巴西綠膠，主要植物來源是克魯西屬。分別制備中國蜂膠乙醇提取物（EECP）、巴西蜂膠乙醇提取物（EEBP）、中國蜂膠水提物（WEP）、中國蜂膠乙酸乙酯提取物（EAEP）提取物。短葉松素、咖啡酸苯乙酯（CAPE）、咖啡酸芐酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素、木犀草素均從中國蜂膠中分離、提取，并經紫外（UV）和核磁共振（NMR）鑒定，純度為98%以上。3T3-L1前脂肪細胞由聊城大學生命科學院細胞實驗室保存。

1.2主要儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養箱：力康生物醫療科技控股有限公司；TE2000S倒置熒光顯微鏡：日本Nikon公司；MK3酶標儀：芬蘭雷勃公司；AR2140電子分析天平：美國奧豪斯公司；Milli-Q Synthesis超純水：美國密理博公司。

1.3方法

1.3.1細胞的培養

3T3-L1前脂肪細胞培養在添加10%胎牛血清的DMEM培養基中，孵育條件為：5%CO2、37℃、飽和濕度CO2培養箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.2細胞存活率的測定

將處于對數生長期的細胞按4 000個/孔種植到96孔板，37℃，5%CO2孵育，待3T3-L1前脂肪細胞長到80%以上，除正常組外所有處理組分別經不同濃度的中國蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物（12.5、25、50 μg/mL），中國蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物（6.25、12.5、25、50、100 μg/mL），CAPE和咖啡酸芐酯（2.5、5、10、20、40 μmol/L），短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素（20、40、80 μmol/L）分別處理細胞24后，棄細胞培養液，用10%三氯乙酸4℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測吸光值。

細胞存活率/%=（處理組OD值/對照組OD值）×100

1.4數據統計

采用SPSS v11.5軟件包統計分析。計量資料以均數±標準差（x±S）表示，采用t檢驗進行統計學分析。P＜0.05為差異顯著。

2　結果

2.1不同濃度的中國蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響

不同濃度的中國蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響見圖1。

圖1　不同濃度的中國蜂膠和巴西蜂膠乙醇提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響Fig.1　Effect of different concentrations of EECP and EEBP on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖1可以看出，EEBP對3T3-L1前脂肪細胞存活率影響不顯著，而EECP隨著濃度的升高顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖，EECP在濃度為50 μg/mL時對3T3-L1前脂肪細胞的抑制率為23%。

2.2不同濃度的中國蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響

不同濃度的中國蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響見圖2。

圖2　不同濃度的中國蜂膠水提物和乙酸乙酯提取物對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響Fig.2　Effect of different concentrations of WEP and ethyl acetate extract of proplis on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖2可以看出，中國蜂膠乙酸乙酯提取物和水提取物在濃度為6.25 μg/mL～12.5 μg/mL時對3T3-L1前脂肪細胞存活率影響不顯著，但隨著濃度的升高，顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖，且具有濃度依賴性。此外，同濃度的乙酸乙酯提取物比水提取物更顯著地抑制細胞增殖。

2.3不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響

不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響見圖3。

圖3　不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響Fig.3　Effect of different concentrations of CAPE and caffeic acid benzyl ester on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖3可以看出，不同濃度的咖啡酸苯乙酯和咖啡酸芐酯在濃度大于5μmol/L時顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖，且具有劑量依賴性。

2.4不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響

不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響見圖4。

圖4　不同濃度的短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響Fig.4　Effect of different concentrations of pinobanksin，apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on cell viability of 3T3-L1 cells

由圖4可以看出，短葉松素、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素和木犀草素在20 μmol/L時對3T3-L1前脂肪細胞的增殖作用影響不顯著，隨著濃度的升高對細胞的抑制作用顯著增強。在80 μmol/L時，高良姜素對3T3-L1前脂肪細胞抑制率達到24%。

3　討論

目前肥胖已成為危害人類健康的全球性健康問題，它與糖尿病、高血壓、心腦血管疾病及腫瘤等多種疾病的發生、發展密切相關。如今，隨著生活方式的改變，特別是高熱量、高蛋白、高脂肪的攝入，肥胖的人越來越多，因此，開發和利用能增加基礎代謝率，抑制體內脂肪合成，促進脂肪氧化，預防肥胖的功能性食品，對提高國民的生活質量，保護人體健康具有重要的意義。

在中醫看來蜂膠是珍貴的天然藥物，它含有600多種成分，是一個名副其實的小藥庫。它由動植物精華有機結合而成，性味平和、無毒副作用，可調節人體陰陽、氣血平衡、“扶正祛邪”、防病治?。?3-14］。蜂膠的基本成分是50%的樹脂（黃酮和相關酚酸），30%的蠟和20%的其他成分［15］。中國蜂膠主要為酚酸類和黃酮類化合物，而巴西蜂膠主要為香豆酸類物質［16］。目前的結果表明，巴西蜂膠乙醇提取物對前脂肪細胞增殖影響不顯著，而中國蜂膠乙醇提取物隨著濃度的增加顯著抑制前脂肪細胞的增殖。不同提取方法的中國蜂膠對前脂肪細胞的影響也不同，乙酸乙酯提取物的抑制功效較乙醇提取物和水提物更顯著。此外，蜂膠中不同的組分對前脂肪細胞的影響不同，CAPE和咖啡酸芐酯對前脂肪細胞的抑制較其它黃酮類化合物更強，而且不同黃酮類化合物之間，高良姜素的抑制功效更強。由此可以看出，不同來源的蜂膠，同一來源不同提取方法的蜂膠以及蜂膠中不同的組分對前脂肪的影響均不同，需要進一步深入的研究。

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The Proliferation Effect of Propolis and Its Extracts on 3T3-L1 Preadipocytes Cells

WANG Yue-hua，FU Chong-luo，ZHANG Li，XUAN Hong-zhuan*
（School of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

To study the effects of ethanol extract of Brazilian propolis（EEBP），ethanol extract of Chinese propolis（EECP），ethyl acetate extract of Chinese propolis（EAEP）and water extract of Chinese propolis（WEP）and the major constituents of propolis such as pinobanksin，caffeic acid benzyl ester，caffeic acid phenethyl ester（CAPE），apigenin，pinocembrin，chrysin，galangin and luteolin on 3T3-L1 preadipocytes cells.the normal cultured 3T3-L1 preadipocytes cells were treated with different concentrations of EEBP，EECP，EAEP，WEP and various constituents for 24 h，respectively.The cell viability was measured by SRB method.The inhibitory proliferation effects of propolis and its various constituents on 3T3-L1 cell were different，and EECP，EAEP and caffeic acid phenylethyl ester（CAPE）had a stronger inhibition activity on 3T3-L1 cells.Propolis and its major constituents inhibit the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes cells.

propolis；ethyl acetate extract of Chinese proplis；water extract of Chinese proplis；3T3-L1 preadipocytescells

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.001

國家自然科學基金（31201860）；聊城大學基金（31805，318011317）

王月華（1990—），女（漢），碩士生，研究方向：細胞生物學。*通信作者：玄紅專（1978—），女（漢），副教授，博士。

2015-12-24