miR-152在非小細胞肺癌患者血清中的表達及臨床意義

強 勇，楊 楠，張 雷，李 鵬，劉 凱，吳海衛，申 翼，李忠東

(南京軍區南京總醫院心胸外科 210002)

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論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.023

miR-152在非小細胞肺癌患者血清中的表達及臨床意義

強 勇，楊 楠，張 雷，李 鵬，劉 凱，吳海衛，申 翼，李忠東△

(南京軍區南京總醫院心胸外科 210002)

[摘要] 目的 通過檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清中microRNA-152(miR-152)的水平，探討其與NSCLC的關系。方法 采用Real time-PCR法檢測61例NSCLC患者和80例健康對照者血清miR-152的表達水平，并分析其與臨床病理指標間的關系。結果 NSCLC組血清miR-152 的表達水平顯著降低(P<0.01)。且其表達量與患者吸煙史和TNM分期有關，有吸煙史的NSCLC晚期的患者表達更低(P<0.05)，而在不同年齡、性別、組織學類型、腫瘤分化間差異無統計學意義(P>0.05)。根據miR-152的表達水平繪制ROC曲線，曲線下面積為0.820(95%CI=0.752～0.889)，臨界值取0.48時，靈敏度和特異度分別為63.80%和90.20%。結論 NSCLC患者血清中miR-152表達低，且與腫瘤分化程度相關，miR-152可能作為NSCLC診斷的特異腫瘤標志物。

miR-152；癌，非小細胞癌；逆轉錄聚合酶鏈反應；ROC曲線

[Abstract] Objective Tto investigate the expression of microRNA-152(miR-152)in the serum of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)，and to explore the clinical significance of NSCLC.Methods The relative expression levels of miR-152 in serum of 61 NSCLC patients and 80 healthy individuals were assessed by quantitative real-time PCR(RT-PCR),and the clinical pathological parameters was analyzed.Results The expression of miR-152 was significantly lower in the serum of NSCLC than that of controls(P<0.01).Down regulation of miR-152 was found to be correted with the clinicopathological features such as smoking histroy and TNM staging(P<0.05),but there was no significant difference in different age,sex,histological type and tumor differentiation(P>0.05).The ROC curve for miR-152 revealed a strong diagnostic performance,the value of the area under ROC(AUC-ROC)was 0.820(95%CI：0.752-0.889),optimal sensitivity and specificity were 63.80% and 90.20% when 0.48 was selected as the critical value.Conclusion It was found that miR-152 is significantly reduced in serum samples of NSCLC patients,and the data suggests that it may be a particular biomarker for the clinical diagnosis of NSCLC.

肺癌，尤其是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是人類罹患癌癥死亡的主要原因，每年全球有超過500 000人死亡[1]。盡管近年來在NSCLC的早期發現和治療上有所進步，但其高病死率并未顯著下降。NSCLC往往在確診時已屬晚期，且5年生存率低于15%[2]。NSCLC的不良預后主要是由于缺乏規范有效而又經濟實用的診斷方式，以便能夠篩選出早期的腫瘤。有文獻報道及時診斷治療早期NSCLC可將患者5年生存率提高到60%～80%[1,3]，所以開發這樣的生物標志物是一個關乎公共健康，勢在必行的舉措。微小RNA(miRNAs)是一類含量豐富的，包含17～25個核苷酸的小的非編碼RNA，它通過直接結合到靶mRNA的3′端非翻譯區(3′UTR區),從而在轉錄后水平調控基因表達[4-5]。miRNAs是一類重要的調節因子，參與到很多生理病理過程，例如細胞生長、分化、凋亡及腫瘤的發生、轉移、惡化[6-7]。鑒于它的多功能性，miRNAs的表達水平或許能夠作為腫瘤的標志物。miR-152屬于miR-148/152家族[8]，已經確定它在標本和細胞系下調[9-10]。然而，miR-152在NSCLC患者血清中的表達報道還不多。因此,在本研究中，筆者通過檢測61例NSCLC患者和 80例健康個體血清miR-152的表達水平，來分析其表達與患者臨床資料間的聯系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 血樣來自2014年3月至2015年4月在本院接受原發性NSCLC手術切除的患者61例(NSCLC組)，原發性NSCLC均為初次發現，均經病理組織學確診，術前未行任何抗腫瘤治療。患者中男40例，女21例，中位年齡60歲(32～77歲)。病理類型包括鱗癌26例，腺癌30例，腺鱗癌5例。TNM分期按照國際肺癌研究會(IASLC)公布的標準，Ⅰ/Ⅱ期37例，Ⅲ/Ⅳ期24例。本研究經本院醫學倫理學委員會批準，患者簽署知情同意書。此外，選取本院同期80例體檢中心健康個體為對照組，男50例，女30例，年齡28～72歲，中位年齡58歲。經檢查均無肝、肺、腎、腦等臟器疾病，無消化道和血液系統疾病史。研究對象均于清晨空腹采血3～5 mL于促凝管中，3 000 r/min離心10 min分離血清，吸取上清液并迅速置于-80 ℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 基因擴增檢測儀LightCycler480RⅡ購自德國Roche公司；miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購自Tiangen公司；引物均由上海英駿生物技術有限公司合成并修飾。

1.3 總RNA提取 按miRcute miRNA提取試劑盒說明書抽提血清，用核酸蛋白檢測儀在OD260/280 nm處測定OD值，計算miRNA的含量及純度。利用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄成20 μL cDNA，cDNA樣本置-20 ℃保存備用。

1.4 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)檢測 擴增所用的miR-152和U6的引物序列見表1。PCR總反應體系為20.0 μL，內含2×miRcute miRNA Premix 10.0 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，其余加雙蒸水補足。擴增條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s(溫度轉換率均為20 ℃/s)，擴增40個循環。60 ℃延伸時采集熒光信號，所有樣品均做復孔，miR-152的相對表達量用2-ΔΔCt法表示。

表1 miRNAs的引物序列

2 結 果

2.1 miR-152的表達水平 miR-152的相對表達量通過同一樣本miR-152與U6的比值來表示。NSCLC患者血清miR-152 的表達量為0.23±0.19，顯著低于對照組的1.54±0.67，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.2 肺癌患者臨床參數與miR-152表達的關系 分析NSCLC患者中miR-152表達水平與患者年齡、性別、吸煙史、組織學類型、腫瘤分化及TNM分期等臨床病理參數的關系。結果顯示，miR-152在有吸煙史的患者中表達量低于無吸煙史的患者(P<0.05)；且晚期患者miR-152表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 miR-152對NSCLC的診斷價值 對61例NSCLC患者血清miR-152水平建立ROC曲線，見圖2，利用ROC曲線評價miR-152的診斷價值。AUC為0.820(95%CI：0.752～0.889)。當臨界值取0.48時，靈敏度和特異度分別為63.80%和90.20%。

>a：P<0.05。

圖1 NSCLC組和對照組血清的miR-152表達水平

圖2 miR-152 ROC曲線

項目占比n(%)miR?152相對表達量P性別>0．05 男40(65．6)0．25±0．09 女21(34．4)0．20±0．08年齡>0．05 <60歲27(44．3)0．17±0．07 ≥60歲34(55．7)0．25±0．09吸煙史<0．05 不吸煙30(49．2)0．29±0．11 吸煙31(50．8)0．12±0．06組織學類型>0．05 鱗癌26(42．6)0．27±0．10 腺癌30(49．2)0．17±0．08 腺鱗癌5(8．2)0．14±0．04腫瘤分化>0．05 中分化19(31．2)0．17±0．09 中低分化18(29．5)0．20±0．11

續表2 NSCLC患者臨床參數及其與血清中miR-152水平的關系

3 討 論

miRNAs非常穩定，即使是在成分復雜的富含RNase酶的血清中，也可以長時間存在[11]。在某些疾病包括NSCLC中，它們的表達水平會發生變化[12]，由此他們可被選作生物標志物，用來檢測疾病的發生和進展。目前，一些在疾病發病過程中有明顯改變的miRNAs，已作為新型的血液標志物應用到這些疾病的診斷和預后上。NSCLC病死率居全球癌癥前兩位，迄今為止仍然無非?？煽康纳镏笜藖碓\斷早期的NSCLC。

本研究中，作者通過定量RT-PCR檢測血清中miR-152的表達，發現miR-152在NSCLC患者中顯著下調(P<0.001)。進一步分析發現miR-152與臨床病理特征，如患者的吸煙史、TNM分期相關(P<0.05)。ROC曲線顯示血清miR-152能作為診斷NSCLC的可靠生物標志物，其AUC為0.820(95%CI：0.752～0.889)，靈敏度和特異度分別達到63.80%和90.20%。本試驗證實miR-152的表達水平在NSCLC患者和健康個體中顯著不同，依據其表達差異，miR-152可用于篩選患NSCLC的個體。這一研究表明，血清中的miR-152可作為區分NSCLC的一種新型的非侵入性生物標志物。

已有文獻報道了miR-152在很多腫瘤中表達下調，例如miR-152在HBV相關的肝癌組織中表達下調[13]；Chen等[14]報道了胃腸道腫瘤組織及細胞株中miR-152表達顯著降低，并且降低的程度與腫瘤組織大小及腫瘤分期密切相關；而在肺癌方面，Cheng等[9]通過檢測30例NSCLC患者的腫瘤組織和正常組織發現miR-152在肺癌組織中表達下降，并與其預后不良相關；Su等[10]證實這一結果，并且發現上調miR-152表達能明顯抑制NSCLC細胞的增殖、克隆形成及遷移和侵襲。進一步分析表明了miR-152通過下調靶基因FGF2和ADAM17的表達[9-10]，從而抑制NSCLC的增殖和侵襲。雖然對NSCLC腫瘤中miR-152的研究較多，但對NSCLC患者外周血中miR-152研究較少，作者的研究填補了這一空缺，也證實miR-152在NSCLC患者血清中的表達與之前組織中的報道一致，均顯著減少。但是因為本研究所選用的樣本數較少，所以研究結果還帶有一定的局限性。

綜上所述，本研究發現miR-152在NSCLC患者的血清中表達顯著減少。檢測外周血中miR-152的可作為一種無創性、快速的診斷工具，用于篩選患NSCLC的個體。下一步筆者將收集更多患呼吸道疾病的血清樣本，進一步確定miR-152的表達是否可作為一個潛在的預測NSCLC的生物標志物。

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Serum microRNA-152 expression and its clinical significance in patients with non-small cell lung cancer

QiangYong，YangNan，ZhangLei，LiPeng，LiuKai，WuHaiwei，ShenYi，LiZhongdong△

(DepartmentofCardiothoracicSurgery，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing，Jiangsu210002，China)

microRNA-152；carcinoma,non-small cell lung；R7-PCR；Roc curve

強勇(1978-)，主治醫師,碩士,主要從事肺癌基礎與臨床研究?！?/p>

R735.1

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1671-8348(2016)28-3956-03

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2016-07-20)