CTLA4基因多態性與Graves病的關系

李曉麗,孫衛華,吳晨辰,趙文娣,張曉梅

(蚌埠醫學院第一附屬醫院內分泌科，安徽蚌埠 233000)

?

論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.011

CTLA4基因多態性與Graves病的關系

李曉麗,孫衛華,吳晨辰,趙文娣,張曉梅△

(蚌埠醫學院第一附屬醫院內分泌科，安徽蚌埠 233000)

[摘要] 目的 探討細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4)基因單核苷酸多態(SNP)rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804與彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves)病的關系。方法 以中國安徽蚌埠地區698例Graves病患者(Graves病組)和571名健康體檢者(對照組)作為研究對象。應用TaqMan探針技術，分別檢測兩組的CTLA4基因SNP rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804基因型；同時檢測Graves病患者促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)水平。結果 在4個SNP位點中，rs1024161_A與Graves病易感性顯著相關(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI：1.21～1.68)；Logistic回歸分析提示rs1024161是Graves病的獨立易感位點。在rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG 3種基因型間比較，血清TRAb水平及其他臨床表現的差異無統計學意義(P>0.05)。結論 CTLA4基因上rs1024161與中國安徽蚌埠地區漢族人群Graves病明顯相關，并且是一個獨立易感位點。

格雷夫斯病；CTLA4基因；受體，促甲狀腺激素釋放激素；多態性，單核苷酸

[Abstract] Objective To investigate the associations between CTLA4 gene polymorphisms at positions rs10197319,rs1024161,rs231726,rs231804 and Graves′ disease(GD).Methods The subjects in this research consists of 698 cases of GD patients and 571 healthy controls from Bengbu city.Genotyping of the four SNPs rs10197319,rs1024161,rs231726,rs231804 was performed using a TaqMan PCR assay;meanwhile,serum concentrations of thyroid stimulating hormone receptor antibody(TRAb)of the patients were also detected.Results Among the four SNPs,rs1024161_A was significantly associated with GD in the Chinese Han population(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI:1.21-1.68).Logistic regression suggested that rs1024161 was an independent susceptibility locus of GD.Furthermore,serum TRAb concentration and the other clinical features didn′t reach statistical significance among rs1024161_AA,AG and GG genotypes(P>0.05).Conclusion The rs1024161 in CTLA4 gene was significantly associated with GD in the Chinese Han population from Bengbu city,and it may function as an independent susceptibility locus of GD.

彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves)病，是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，影響著約0.50%～1.30%的西方人群，0.25%～1.09%的中國人群[1]。Graves病的發病機制尚未完全明確，一般認為Graves病的易感性由遺傳和環境共同決定[2]，在感染、精神創傷等因素作用下，誘發體內的免疫功能紊亂，這些因素共同作用于T細胞、B細胞，導致抗原識別和遞呈的調節紊亂，使之產生了針對促甲狀腺激素受體的自身刺激性抗體，從而引起甲狀腺功能亢進。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA4)是許多自身免疫性疾病的共同易感基因，如Graves病、糖尿病、自身免疫性Adison病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等。其中，CTLA4基因與Graves病相關聯已在不同的國家、地區、種族的人群中得到驗證。目前，關于CTLA4基因多態性的研究報道多局限于以下單核苷酸多態(single nucleotide polymorphism，SNP)位點：啟動子區的-318C/T(rs5742909)、第1個外顯子+49A/G(rs231775)、第1個內含子+1 822C/T(rs231779)和3′非翻譯區的CT60A/G(rs3087243)。全基因組關聯研究及擴大樣本驗證該基因包括多個多態性位點[3]，其中包括本研究所驗證的SNPs位點rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804。目前，該基因上真正的致病、易感SNP位點，尚未完全清楚，為此，本研究對中國安徽蚌埠地區漢族人群Graves病患者CTLA4基因上SNPs位點rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804作了進一步的研究，以探討CTLA4基因與Graves 病及其臨床表型的關系。另外，已有報道證實促甲狀腺激素受體抗體(thyroid stimulating hormone receptor antibody，TRAb)陽性與促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor，TSHR)基因有關[4]，但TRAb陽性是否與CTLA4基因相關聯，國內這方面的研究較少，本研究亦對其進行闡述。

1 資料與方法

1.1 一般資料 Graves病組698例來自于2009年3～10月在蚌埠醫學院第一附屬醫院就診的Graves病患者，其中男131例(18.8%)，女567例(81.2%)，平均年齡(39.24±14.40)歲。Graves病診斷依據：除有(1)高代謝癥狀和體征；(2)甲狀腺彌漫性腫大；(3)血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)或三碘甲腺原氨酸(T3)、血清四碘甲腺原氨酸(T4)增高，(TSH)減低的表現之外，還需要具有以下條件之一：(1)浸潤性突眼；(2)TRAb陽性；(3)脛前黏液性水腫[5]。甲狀腺腫大程度依體格檢查分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度，Graves病眼征分級采用1977年美國甲狀腺協會(ADA)提出的分級標準分為0～6級[6]，復發與否結合病史回顧和臨床資料，以正規臨床治療治愈半年后是否再次出現甲狀腺功能亢進表現來界定。對照組571例，為本院健康體檢中心體檢者，其中男114例(20.0%)，女457例(80.0%)，平均年齡(44.47±13.94)歲，甲狀腺功能正常且無甲狀腺疾病史和自身免疫性甲狀腺疾病家族史，個體之間無親緣關系，性別匹配，年齡大于或等于40歲(以排除遲發型自身免疫病患者)。兩組均為中國漢族人群。研究方案經蚌埠醫學院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法 (1)采集臨床資料：如性別、年齡、發病年齡、甲狀腺腫大程度、突眼程度、復發與否等；(2)基因組DNA提取：采集研究對象外周血2 mL，枸櫞酸鈉抗凝。使用Fujifilm QuickGene-610L機器及全血DNA提取試劑提取DNA，用Nanodrop8000(Thermo公司)進行DNA濃度測定，樣本DNA純度A260/A280 1.8～2.0。進一步將樣本DNA濃度稀釋到50 ng/μL用于基因分型；(3)CTLA4基因上SNPrs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804基因分型：其TaqMan探針由美國ABI公司合成，使用Fluidigm96x96 Dynamic Array在Fliudigm EPL平臺上進行PCR反應、基因分型與檢測；(4)血清指標的測定：收集研究對象外周靜脈血3 mL離心分離血清，用免疫化學發光法對Graves病患者血清甲狀腺激素進行測定。用TSHR ELISA酶標試劑盒(英國RSR公司)測定患者血清TRAb水平，并以1.5 U/L為界，分為陽性組(≥1.5 U/L)和陰性組(<1.5 U/L)。

2 結 果

2.1 CTLA4基因上4個SNPs基因分型結果及與Graves病發病的相關性 對照組、Graves病組的CTLA4基因的4個SNP的基因型和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.33、0.44、0.98、0.45)，提示樣本具有群體代表性。在4個SNP中，rs1024161_A與Graves病易感性顯著相關(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI：1.21～1.68)，其余3個SNP無明顯差異性(P>0.05)；rs1024161基因分型得到AA、AG、GG 3種基因型，A等位基因相對于G等位基因的OR值為1.43，A為易感基因，G為保護基因，Graves病組AA基因型頻率顯著高于對照組(47.40% VS.32.20%，P<0.01)；Graves病組rs1024161_A等位基因頻率顯著高于對照組(69.48%VS.61.47%，P<0.01)，可見Graves病組攜帶易感等位基因的比例高，見表1。

2.2 CTLA4基因上4個SNP基因的Logistic回歸分析 以Graves病為因變量，以rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804為自變量進行Logistic非條件逐步回歸分析，結果顯示rs1024161是Graves病的一個獨立易感位點(P=7.99×10-7)。

2.3 Graves病組rs1024161不同基因型與臨床資料的比較 按照rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG的3種基因型分為3個亞組，分析Graves病rs1024161基因型與患者臨床資料的相關性。經χ2檢驗結果顯示rs1024161不同基因型與性別、血清TRAb水平、甲狀腺腫大程度、眼征、復發與否的相關性均無統計學意義(P>0.05)。單因素方差分析結果顯示rs1024161不同基因型與發病年齡也無明顯相關性(P>0.05),見表2。

a:P<0.01，與對照組比較。

表2 Graves病組患者rs1024161不同基因型與臨床資料的比較

續表2 Graves病組患者rs1024161不同基因型與臨床資料的比較

3 討 論

Graves病是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，其發生與基因和環境因素相互作用有關，一直以來CTLA4基因被認為是Graves病的主要候選基因[7-8]。人類CTLA4基因位于2號染色體長臂3區3帶(2q33)，包括4個外顯子、3個內含子和1個前導序列。CTLA4啟動子與外顯子的多態性可影響CTLA4分子的表達，從而影響其生物學功能，如當CTLA4啟動子-318位點為胸腺嘧啶，外顯子1第49位點為腺嘌呤時，細胞表達的CTLA4水平增高。CTLA4外顯子1的多態性還與CTLA4的功能有關，如CTLA4外顯子1中G等位基因頻率增高，CTLA4抑制T細胞增殖的功能降低，從而促發Graves病和可能導致其他自身免疫性疾病的發生。由此可見，CTLA4基因多態性與CTLA4的表達和功能缺陷相關，參與Graves病的發生。

目前，不同地區、種族的CTLA4基因與Graves病的遺傳易感性研究報道并不一致。Yang等[9]對中國漢族人群研究發現CTLA4±t49A/G SNP與自身免疫性甲狀腺疾病明顯相關。Esteghamati等[10]在對伊朗Graves病患者的研究中發現CTLA4外顯子1 +49A/G的G等位基因與Graves病相關，且CTLA4位點是獨立于HLA-DRB1和HLA-DQBl之外的獨立易感位點，可見，在Graves病相關的易感基因中CTLA4基因的地位更高。但是，Namo等[11]對巴西兒童和成人Graves患者的研究中則發現病例組CTLA4基因外顯子1 +49 A/G S～P和正常對照組差異有統計學意義(P>0.05)。在對CTLA4啟動子-318位點C/T基因的多態性與Graves病關聯的研究中，Han等[12]認為，CTLA4啟動子-318位點為T時，啟動子活性較高，可以上調CTLA4的表達水平。但是Esteghamati等[10]在伊朗Graves病患者的研究中并未發現此相關性。以上表明不同種族間，CTLA4等位基因易感性存在很大的差別，因此，本研究旨在探討CTLA4基因多態與中國漢族人群Graves病發生的相關性。

本研究發現Graves病組患者rs1024161_A的頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P=2.28×10-5，OR=1.43，95%CI:1.21～1.68)，rs1024161位點A/A基因型攜帶者對Graves病易感,即G/G基因型攜帶者Graves病的患病率較低，提示了CTLA4基因上rs1024161位點是中國安徽蚌埠地區漢族人群Graves病發生的易感位點。

TRAb是一種參與Graves病發生的重要的自身抗體，是該病的重要自身免疫指標。Khalilzadeh等[13]對Graves病患者CTLA4外顯子1 A/G多態性進行分析，結果提示A/G(49)SNP與TRAb的產生顯著相關。Bednarczuk等[14]研究發現CTLA4基因第1外顯子位點49處為GG基因型的Graves病患者體內TRAb水平較高。但Chen等[15]在對中國廣東省鎮江地區漢族人群的研究發現Graves病患者CD40-1C>T 和CTLA4+6230G>A多態性與血清TRAb水平無明顯相關性。本研究也未發現病例組血清TRAb水平與rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG基因型之間有關聯。國外研究發現TRAb由機體識別自身抗原TSHR誘導產生[16]，而CTLA4和TSHR均為Graves病的主要候選基因，作者推測rs1024161_AA攜帶者血清CTLA4可溶性A亞基升高，有可能被外周局部淋巴結攝取誘導免疫反應導致TRAb水平增高，但結果與推測不符，可能受本組研究樣本量有限及所研究人群的種族、地域環境影響。Graves病的其他臨床表現如性別、發病年齡、甲狀腺腫大程度、Graves病眼病分級、復發與否在3種基因型之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，尚需要進一步擴大樣本量研究以明確其與CTLA4基因多態性的關聯性。 綜上所述，CTLA4基因是Graves病的一個重要易感基因，其多態性位點rs1024161與中國安徽蚌埠地區漢族人群Graves病發病相關，但CTLA4基因增加Graves病患病風險的具體機制尚不清楚，有待進一步的遺傳學和功能研究，以進一步了解Graves病的發病機制，為Graves病預防和基因免疫治療提供理論依據。

[1]Hollowell JG,Staehling NW,Flanders WD,et al.Serum TSH,T(4),and thyroid antibodies in the United States population(1988 to 1994):National Health and Nutrition Examination Survey(NHANES Ⅲ)[J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(2):489-499.

[2]Vos XG,Endert E,Tijssen JG,et al.Genotypes in relation to phenotypic appearance and exposure to environmental factors in Graves′ hyperthyroidism[J].Eur J Endocrinol,2012,167(6):783-792.

[3]Chu X,Pan CM,Zhao SX,et al.A genome-wide association study identifies two new risk loci for Graves′ disease[J].Nat Genet,2011,43(9):897-114.

[4]Liu BL,Yang SY,Liu W,et al.Refined association of TSH receptor susceptibility locus to Graves′ disease in the Chinese Han population[J].Eur J Endocrinol,2014,170(1):109-119.

[5]中華醫學會內分泌學分會．中國甲狀腺疾病診治指南[J]．中華內科學雜志，2007,46(10)：876-882．

[6]Werner SC.Modification of the classification of the eye changes of Graves′ disease:recommendations of the Ad Hoc Committee of the American Thyroid Association[J].J Clin Endocrinol Metab,1977,44(1)：203-204.[7]宋懷東．彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進癥致病易感基因識別鑒定研究的現狀[J].中華內分泌代謝雜志,2011,27:961-966．

[8]Inoue N,Watanabe M,Yamada H,et al.Associations between autoimmune thyroid disease prognosis and functional polymorphisms of susceptibility genes,CTLA4,PTPN22,CD40,FCRL3,and ZFAT,previously revealed in genomewide association[J].J Clin Immunoc,2012,32(6):1243-1252.

[9]Yang J,Qin Q,Yan N,et al.CD40 C/T-1 and CTLA-4 A/G(49)SNPs are associated with autoimmune thyroid diseases in the Chinese population[J].Endocrine,2012,41(1):111-115.

[10]Esteghamati A,Khalilzadeh O,Mobarra Z,et al.Association of CTLA4 gene polymorphism with Graves'disease and ophthalmopathy in Iranian patients[J].Eur J Intern Med,2009,20(4):424-428.

[11]Namo CA,Longui CA.Graves'disease in Brazilian children and adults:lack of genetic association with CTLA4+49A>G polymorphism[J].Horm Res,2008,70(1):36-41.

[12]Han SZ,Zhang SH,Li R,et al.The common -318C/T polymorphism in the promoter region of CTLA4 gene is associated with reduced risk of ophthalmopathy in Chinese Graves' patients[J].Int J Immunogenet,2006,33(4):281-287.

[13]Khalilzadeh O,Moiazi AH,Tahvihtari M,et al.Pretibial myxedenm is assoeiated with polymorphism in exon 1 of CTLA4 gene in patients with Graves'ophthalmopathy[J].Arch Dennatol Res,2009,301(10):719-723.

[14]Bednarczuk T,Telichowska A,Skoeka A,et al.Association of CTLA4 gene polymorphism with clinical characteristics of Graves'disease[J].J Endocrinol Invest,2001,24(suppl 6):60.

[15]Chen XM,Hu ZQ,Li W,et al.Synergistic combined effect between CD40-1C>T and CTLA-4+6230G>A polymorphisms in Graves' disease[J].Gene,2015,567(2):154-158.

[16]Brand OJ,Gough S.Genetics of thyroid autoimmunity and the role of the TSHR[J].Mol Cell Endocrinol,2010,322(1/2):135-143.

The relationship between CTLA4 gene polymorphisms and Graves′ disease*

LiXiaoli,SunWeihua,WuChenchen,ZhaoWendi,ZhangXiaomei△

(DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu,Anhui233000,China)

Graves′ disease；CTLA4 gene；receptor,thyrotropin-releasing hormsne；polymorphism,sing/e nucleotide

安徽省教育廳基金資助項目(KJ2013A187)。 作者簡介：李曉麗(1984-)，主治醫師，本科，主要從事內分泌代謝方面的研究。△

R581.1

A

1671-8348(2016)28-3922-03

2016-06-11

2016-07-01)