促紅細胞生成素載體的構建、分離純化及其活性檢測

潘佳欣，高秀峰△，趙佳浩，羅亞雄，吳曉婷，李永生

(四川大學：1.華西基礎醫學與法醫學院；2.化學工程學院，成都 610065)

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論著·基礎研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.008

促紅細胞生成素載體的構建、分離純化及其活性檢測

潘佳欣1，高秀峰1△，趙佳浩1，羅亞雄1，吳曉婷1，李永生2

(四川大學：1.華西基礎醫學與法醫學院；2.化學工程學院，成都 610065)

[摘要] 目的 為了進一步考察促紅細胞生成素(EPO)的組織保護作用,構建了高效表達人源性EPO(rhEPO)的原核表達載體，并通過小鼠體內實驗考察了其促紅細胞生成活性。方法 構建原核表達載體pET30b(+)-rhEPO；轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得高效表達重組轉化子菌株；Ni-NAT親和層析純化融合蛋白；利用網織紅細胞指數考察融合蛋白在小鼠體內的促紅細胞活性。結果 成功構建pET30b(+)-rhEPO重組子；實現了在原核生物中的表達；純化后的融合蛋白達到了電泳級純；其相對分子質量與理論值相符，原核表達的融合蛋白能夠顯著提高小鼠體內網織紅細胞數，可溶性融合蛋白和包涵體蛋白比活性分別是應用化學科1 059.63 、727.94 U/mg。結論 構建和表達重組載體pET30b(+)-rhEPO，表達的目的蛋白經分離純化后具有體內生物學活性，為進一步的功能研究奠定基礎。

紅細胞生成素；遺傳載體；分離和提純；活性檢測

[Abstract] Objective To construct the efficient expression vector of the human-derived erythropoietin,and investigate its in vivo activity through experiment in mice,in order to study the tissues protective function for the further research.Methods Prokaryotic expression vector pET30b(+)-rhEPO was constructed,transformed into E.coli BL21(DE3),to obtain low-cost and efficient expression of recombinant transformant strains,fusion protein purificated by Ni-NAT affinity chromatography column,and in vivo activity detected through animal experiment.Results Successfully constructed pET30b(+)-rhEPO prokaryotic expression vector,and realized the expression in prokaryotes.The purified fusion protein showed expected molecular weight and reached the electrophoretic purity level,the reticulocyte number in rats increased significantly showed that the fusion protein has in vivo activity,the specific activity of soluble fusion protein is 1 059.63 μ/mg,and the insoluble fusion protein is 727.94 μ/mg.Conclusion Construction and expression the prokaryotic expression vector pET30b(+)-rhEPO,and the fusion protein has in vivo activity after separate and purify,which can be as the foundation for further study of erythropoietin functions.

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)主要是由腎臟分泌的一種糖蛋白類激素，不僅具有刺激骨髓紅細胞系祖細胞分裂、分化為成熟的紅細胞[1]的功能,還具有多種組織器官保護、損傷修復等非造血功能[2-4]。然而EPO在發揮非造血功能時會因用量大,周期長而導致血液黏稠、血栓形成、高血壓等不良反應[5]。因此，開發無促紅細胞生成作用的EPO衍生物成為當今臨床應用研究的熱點之一。近年來有EPO氨甲酰化、EPO模擬肽等無促紅細胞生成作用的EPO衍生物的相關報道[6-8]，但存在成本高、易降解等問題。本研究旨在利用基因工程定點突變技術使EPO突變體在發揮組織保護和修復的同時減少因紅細胞生成過多導致的不良反應，為心、腦、腎等各種組織損傷的治療及藥物的開發提供實驗依據。此階段的研究內容是構建人源性EPO(rhEPO)原核表達載體，目標蛋白的分離純化及其活性的檢測，為進一步功能研究提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 克隆宿主菌DH5α種購于北京全式金生物有限公司；表達宿主菌BL21(DE3)由本實驗室保存；pBLUE-rhEPO,pET30b(+)均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自美國Axygen生物技術公司；NCOⅠ、BamHⅠ限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶均購自美國Thermo Fisher科技公司，IPTG由生工生物工程(上海)股份有限公司進口分裝；Ni-NTA HisoBind resin購于上海七海復泰生物科技有限公司，咪唑由美國Sigma公司生產；煌焦油藍染料購于四川大學華西第二醫院；標準EPO購于四川大學華西醫院，其他常規化學試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體pET30b(+)-rhEPO的構建 pBLUE-rhepo質粒和原核表達載體pET30 b(+)均用NCOⅠ和BamHⅠ雙酶切過夜，經1.5%瓊脂糖電泳后，膠回收目的片段rhepo及pET30b(+)載體大片段，二者經T4 DNA連接酶連接，轉化至DH5α感受態細菌，涂平板,挑取陽性單克隆菌落，活化，提取重組質粒，雙酶切及測序鑒定。

1.2.2 目的蛋白的表達、純化

1.2.2.1 目的蛋白的誘導表達及粗蛋白的獲得 重組質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞，將活化后的工程菌接種到LB培養基中，37 ℃、170 r/min培養3 h，加終濃度為0.5 mmol/L 的異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，20 ℃下誘導表達過夜。3 000 r/min離心10 min,收集沉淀，用20 mL/g菌體的緩沖液B1(0.1 mol/L PBS，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0)重懸菌體,加入10 mg/mL的溶菌酶，室溫靜止30 min，超聲裂解，功率150 W，工作5 s、間歇12 s，共180個循環。4 500 r/min離心，取上清液，12 000 r/min離心，沉淀為包涵體粗蛋白，上清液為可溶性粗蛋白。

1.2.2.2 Ni-NTA親和層析分離純化可溶性蛋白rhEPO 用緩沖液B1平衡鎳柱，將上清粗蛋白液循環上樣；用緩沖液B1洗去未結合雜蛋白；用緩沖液B2(0.1 mol/L PBS，300 mmol/L NacL，30 mmol/L咪唑，pH 8.0)清洗雜蛋白，再用緩沖液B3(0.1 mol/L PBS，300 mmol/L NacL，200 mmol/L咪唑，pH 8.0)進行目標蛋白洗脫并收集洗脫液，分離純化過程用MC99-3自動液相色譜分離層析儀監測，流速為1 mL/min；純化效果經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電冰(SDS-PAGE)鑒定。

1.2.2.3 Ni-NTA親和層析分離純化包涵體蛋白rhEPO 包涵體粗蛋白液經8 mmol/L尿素變性后，分離純化方法同1.2.2.2。

1.2.3 目的蛋白體內活性檢測 將27只昆明小鼠分為生理鹽水組，標準EPO組(2 、4 、8 、12 、16 、20 U組)，樣品EPO組(包涵體組，可溶性上清液組)，共9組，每組3只。腹腔注射EPO 200 μL，連續用藥3 d，于第0天，第4天于眼眶靜脈叢取血，經煌焦油藍染色，涂片,在油鏡下計數至少1 000 個紅細胞中的網織紅細胞數，計算網織紅細胞指數。

2 結 果

2.1 原核表達載體pET30b(+)-rhEPO的構建 將質粒pBLUE-rhEPO和載體pET30 b(+)雙酶切后膠回收結果如圖1所示。目的片段rhEPO和pET30 b(+)大片段的分子量符合理論值。連接轉化DH5α感受態細菌，提取重組質粒DNA，雙酶切,鑒定結果如圖2所示。雙酶切得到了目的片段，原核表達載體構建成功。

M:DNA 分子標記物;1:rhEPO片段;2:pET30b(+)大片段。

圖1 rhEPO和pET30b(+)大片段回收結果

2.2 目的蛋白rhEPO分離純化 樣品經Ni-NTA親和層析柱純化，得到純化的目的蛋白，SDS-PAGE鑒定結果如圖3、4所示，目的蛋白相對分子質量約為28×103，與理論值符合。利用考馬斯亮藍法測定電泳級純的rhEPO蛋白濃度，包涵體rhEPO蛋白濃度為40.8 mg/L，可溶性rhEPO蛋白濃度為21.8 mg/L。

2.3 目的蛋白體內活性檢測 采用網織紅細胞指數法,考察了小鼠第4天網織紅細胞指數，檢測結果如圖6所示。生理鹽水組網織紅細胞為0.442%，包涵體rhEPO網織紅細胞為1.176%,可溶性rhEPO網織紅細胞為1.069%，說明rhEPO融合蛋白具有體內活性。以標準EPO作標準,得到的標準曲線。根據樣品EPO注射后測得的Ret%及融合蛋白濃度計算，得出可溶性rhEPO融合蛋白比活性為1 059.63 U/mg，包涵體rhEPO融合蛋白比活性為727.94 U/mg。

M：DNA 分子標記物;1:pET30b(+)-rhEPO質粒;2：pET30b(+)-rhEPO雙酶切。

圖2 pET30b(+)-rhEPO酶切鑒定結果

M：蛋白分子標記物；1：上清rhEPO粗蛋白液；2：漏出液；3～5：30 mmol/L咪唑洗脫液；6～9:200 mmol/L咪唑洗脫液。

圖3 純化上清rhEPO的SDS-PAGE鑒定

M：蛋白分子標記物；1：包涵體rhEPO；2：漏出液；3:200 mmol/L咪唑洗脫液。

圖4 純化包涵體rhEPO的SDS-PAGE鑒定

3 討 論

EPO是一條含166個氨基酸殘基的高糖基化多肽鏈，由2個二硫鍵連接形成4個穩定的α-螺旋結構。EPO通過與EPO受體(erythropoietin receptor,EPOR)結合發揮功能效應，EPO與經典受體EPOR結合后，EPOR形成同源二聚體，偶聯酪氨酸激酶(Janus tyrosine kinase-2,JAK2)，激活JAK2、轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription-5,STAT5)、信號轉導子、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子κB等，從而啟動下游一系列因子，發揮紅細胞增埴、分化等功能作用[9-12]。研究發現EPO是個多效性因子，可以抗炎、抗氧化、抗凋亡、促進血管的生成、調節細胞營養因子、調節體液免疫等[13]，表現出除了促紅細胞生成作用之外的組織保護和修復的作用。近來研究表明，在一些非造血組織中存在β-common 受體(βcR,CD131)，是IL-3 、IL-5和GM-CSF的受體共同亞單位，能與EPOR形成異源二聚體，發揮組織保護和修復的作用，但不啟動造血信號的轉導[14]。這兩種受體都可以介導組織損傷的修復，但是，EPO對同源受體的親和力遠遠大于對異源受體[15]，因此，EPO在用于組織損傷修復時，必然會導致紅細胞增多，血液粘稠，進一步加重組織損傷。目前,國內外有關EPO衍生物研究中氨甲酰化EPO、去唾液酸化EPO，EPO模擬肽[6-8]表現出組織保護和修復作用而促紅細胞生成作用降低的現象。但是這些衍生物存在成本高或者壽命短的問題，因此，開發低成本高效的新將EPO衍生物對心腦血管的保護顯得尤為重要。

在有關氨甲?；疎PO的研究證實EPO中的賴氨酸氨甲酰化形成高瓜氨酸后，對異源受體的親和力是同源受體的100倍，在對組織修復作用的同時，促紅細胞生成作用下降，由此看出，EPO中的賴氨酸是決定EPO和EPOR同源受體及EPOR-βcR異源受體親和力的關鍵點，通過分析發現谷氨酰胺和高瓜氨酸在結構和理化性質上相似。因此，本研究擬通過基因突變的方法EPO中賴氨酸突變為谷氨酰胺，改變EPO的結構，期望能夠達到氨甲?；疎PO類似的效應。

目前，本研究構建了原核表達載體pET30b(+)-rhEPO，原核表達和純化得到了rhEPO融合蛋白，并檢測出具有生物學活性，其中，可溶性rhEPO融合蛋白比活性為1 059.63 U/mg，包涵體rhEPO融合蛋白比活性為727.94 U/mg。為進一步基因突變及組織保護功能研究奠定了基礎。

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The vector construction,separation,purification and activity detection of human-derived erythropoietin

PanJiaxin1,GaoXiufeng1△,ZhaoJiahao1,LuoYaxiong1,WuXiaoting1,LiYongsheng2

(1.WestChinaSchoolofPreclinicalandForensic；2.SchoolofChemicalEngineering,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610065,China)

erythropoietin；genetic vector；isolation and purification；activity detection

潘佳欣(1990-)，在讀碩士，主要從事蛋白質基因工程研究?！?/p>

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1671-8348(2016)28-3913-03

2016-06-18

2016-07-06)