白細胞介素17在IgA腎病中引起IgA1糖基化異常的作用研究

林佳如，樊均明

(1.成都中醫藥大學中西醫結合臨床學院 610075；2.西南醫科大學附屬第一醫院腎病內科，四川瀘州 646000)

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論著·基礎研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.006

白細胞介素17在IgA腎病中引起IgA1糖基化異常的作用研究

林佳如1,2，樊均明1,2

(1.成都中醫藥大學中西醫結合臨床學院 610075；2.西南醫科大學附屬第一醫院腎病內科，四川瀘州 646000)

[摘要] 目的 對Th17細胞的主要細胞因子白細胞介素17(IL-17)參與介導IgA腎病(IgAN)中B淋巴細胞增殖及IgA-1異常糖基化的過程進行初步研究。方法 以體外培養的DAKIKI細胞為研究對象，在劑量效應分析中，以5～320 ng/mL的IL-17作用48 h，在時間效應分析中以160 ng/mL IL-17刺激24、48、72 h，細胞計數法和CCK-8法檢測細胞增殖狀況，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測DAKIKI細胞培養上清液中IgA1的水平，HAA凝集素檢測IgA1糖基化異常程度。結果 CCK-8和細胞計數法顯示，5～320 ng/mL濃度范圍的IL-17均可明顯刺激B淋巴細胞增殖(P<0.05)；ELISA及HAA檢測結果顯示，與對照組相比，IL-17可引起DAKIKI細胞培養上清液中IgA1水平及異常糖基化的明顯增加(P<0.05)。結論 IL-17呈時間和劑量依賴性地刺激B淋巴細胞的增殖和B淋巴細胞分泌IgA1，并且IL-17刺激B淋巴細胞增生的同時，誘導IgA1的低糖基化異常。

白細胞介素17；腎小球腎炎，IGA；B淋巴細胞；糖基化

[Abstract] Objective To investigate the effect of IL-17 on the production and underglycosylation of IgA1 in a B cell line in IgA nephropathy.Methods DAKIKI cells,which was isolated from B lymphocytes and had the function of secretory IgA,was cultured and treated with different concentrations of IL-17(5,10,20,40,160,320 ng/mL)for 48 h,160 ng/mL IL-17 for different times(24,48,72 h).Then the cell proliferation was examined by cell counting and CCK-8.The production and glycosylation of IgA1 in supernatants were determined by ELISA and helix aspersa(HAA)lectin binding assay,respectively.Results The cell counting and CCK-8 results suggested that the 5-320 ng/mL concentration range of IL-17 could significantly stimulate B lymphocyte proliferation(P<0.05).ELISA and HAA test results showed that compared with the control group,IL-17 could cause DAKIKI cell culture supernatant IgA1 content and abnormal glycosylation significantly increased(P<0.05).Conclusion IL-17 can stimulate the B lymphocyte proliferation and secretion of IgA1 in time and dose dependent and accompanied by increased IgA1 production in vitro,while it also induced underglycosylation of IgA1.

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是全球范圍內最常見的腎小球疾病，其臨床表現多種多樣，主要表現為血尿，幾乎所有患者均表現有血尿。大約25%～50%的患者在疾病診斷后25年內發展到終末期腎衰竭(ESRD)；患者即使接受腎移植，仍有超過50%的患者在腎移植術后2年內IgAN復發。IgAN在歐美國家發病率約為10%，在日本等東南亞地區和澳大利亞其構成比最高為30%～40%[1]。在我國IgAN占原發性腎小球疾病的45.26%，約26.69%的ESRD患者為IgAN所致。IgAN最早被認為是IgA-IgG免疫復合物沉積于腎臟導致的疾病，但是隨著研究的深入，人們逐漸認識到糖基化異常的IgA1是引起IgAN的惟一抗體，從而最終形成免疫復合物沉積在腎小球系膜區，引起腎功能損傷[2]。然而，以腎小球系膜區 IgA 沉積為特點的IGA腎病的發生機制尚未完全了解。近年研究發現，IgA1分子糖基化異常在IgAN的發病機制中發揮著關鍵作用。

Th17細胞是新近發現的一類不同于Th1和Th2細胞的第三類輔助性T細胞亞群，Th17細胞可產生大量的白細胞介素17(IL-17)，Th17細胞介導的絕大多數生物學效應都是通過IL-17起作用。在多發性硬化患者中，IL-17水平增加與病情惡化相關；而在小鼠模型中誘導Th17細胞反應，可促進自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的發生。在銀屑病中，IL-17 mRNA水平與疾病活動性相關；在類風濕性關節炎中，滑膜中IL-17水平與關節損傷嚴重程度相關[3]。總之，目前已有大量研究結果均提示Th17細胞可能參與自身免疫性疾病的發生、發展。

同樣作為自身免疫性疾病的IgAN，Th17細胞是否也在其自身免疫發病機制中發揮作用，目前尚無相關研究報道。但早在2005年發現Th17細胞以前，Matsumoto等[4-5]、Harrington等[6]報道在表現為腎病綜合征的IgAN患者尿液中IL-17水平明顯增加；而由IgAN患者體內分離出的外周血單核細胞(PBMC)給予IL-17刺激后，促炎癥性細胞因子釋放明顯增多[4-6]。上述研究結果提示IL-17可能參與IgAN的發病。Lin 等[7]研究發現，在IgAN患者的血清中，IL-17 的表達逐步增多，且IgAN患者血清中 IL-17 的表達水平與24 h蛋白尿呈正相關[7]。以上結果提示IL-17 可能是IgAN免疫發病機制及進展的重要因素之一。本研究進一步探討Th17細胞及其主要效應因子IL-17參與介導IgAN的分子機制，特別是與IgA1分子糖基化異常相關的生物學機制，從而為IgAN自身免疫發病機制及防治研究提供新的實驗證據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DAKIKI細胞株(ATCC公司，美國)；重組人IL- 17(R&D Systems,公司，美國)；5-Azacytidine(公司，美國)；脂多糖(LPS)、HAA凝集素、辣根過氧化物酶(HRP)偶聯二抗ExtrAvidin(Sigma，美國)；胎牛血清(SH30070，Hyclone公司，美國)；RPMI-1640培養基(Gibco公司，美國)；羊抗人IgA抗體、HRP標記羊抗人IgA抗體(Southern Biotechnology Associates公司，美國)；神經氨酸酶(Roche，德國)；CCK-8試劑盒(KGA317，凱基生物科技發展有限公司，中國)；多功能酶標儀(Infinite M200，TE-can公司，瑞士)；紫外分光光度儀(Nano Drop ND1000，Thermo Fisher,美國)。

1.2 方法 探討IL-17對DAKIKI細胞的增殖，以及刺激IgA1分泌及糖基化異常的機制，并進行劑量[IL-17組(觀察組)：5、10、20、40、80、160、320 ng/mL)、時間(測定3個時間點，分別為24、48、72 h)]依賴分析。

1.2.1 CCK-8法檢測細胞增殖 根據實驗要求，待刺激結束后，每孔加入CCK-8試劑10 μL；將培養板置于37 ℃孵育2 h后，酶標儀上450 nm波長處檢測光密度(OD)值。

1.2.2 酶聯吸附免疫法(ELISA)檢測IgA1濃度 通過包被一抗、封閉、加樣(每孔加入50 μL，設置3個重復孔)、孵育二抗、顯色后在10 min內用酶標儀在450 nm波長處讀取OD值。所有的OD值減去空白孔的OD值再進行計算，以標準品的濃度為橫坐標及所測得的OD值為縱坐標，利用Curve Expert軟件繪制標準曲線；再根據標準曲線計算樣品的IgA1濃度。

1.2.3 HAA凝集素結合試驗檢測IgA1低糖基化程度 通過包被一抗、封閉、加樣(每孔加入50 μL，設置3個重復孔)、神經氨酸酶處理、孵育二抗、顯色后在10 min內用酶標儀在450 nm波長處讀取OD值。

2 結 果

2.1 IL-17對B淋巴細胞的增殖作用

2.1.1 細胞計數檢測IL-17對B淋巴細胞增殖影響 在劑量依賴實驗中，用5～320 ng/mL的IL-17刺激培養B淋巴細胞48 h，細胞計數結果顯示：與對照組(未添加IL-17刺激)比較，不同濃度的IL-17均可促進B淋巴細胞的增殖，但320 ng/mL較160 ng/mL組效果好，見表1。在時間依賴實驗中，采用160 ng/mL的IL-17分別刺激培養B淋巴細胞24、48、72 h，細胞計數結果顯示，與各對應時間點的對照組相比，IL-17組均出現細胞數量明顯增多，見表1。

2.1.2 CCK-8檢測IL-17對B淋巴細胞增殖的影響 用5～320 ng/mL的IL-17刺激培養B淋巴細胞48 h，CCK-8法檢測細胞增殖狀況，OD值越高表示增殖細胞越多。檢測結果顯示，與對照組相比，不同濃度范圍的IL-17均可明顯刺激B淋巴細胞增殖，見表2。

2.2 IL-17對B淋巴細胞分泌IgA1濃度的影響 在劑量依賴實驗中，將5～320 ng/mL的IL-17刺激B淋巴細胞培養48 h，采用ELISA的方法檢測細胞上清液中IgA1的。ELISA結果用OD值表示，值越高代表上清液中的IgA1濃度越高。由結果可見，B淋巴細胞在5～320 ng/mL的IL-17刺激作用下，IgA1的分泌量出現明顯增高，并隨IL-17濃度的增加呈現明顯的劑量-效應關系，見表1。在時間依賴實驗中，采用160 ng/mL的IL-17刺激B淋巴細胞培養24、48、72 h，分別與同一時間點的對照組細胞進行比較。ELISA結果顯示，細胞培養上清液中IgA1的濃度在24 h時無明顯變化(P>0.05)，隨著時間的延長，在48 h和72 h時出現明顯增高(P<0.05)，見表2。

表1 時間依賴實驗中160 ng/mL、IL-17不同作用時間對B淋巴細胞增殖作用、分泌IgA1能力及IgA1異常糖基化作用的影響

a:P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較。

表2 劑量依賴實驗中不同劑量IL-17對B淋巴細胞增殖作用、分泌IgA1能力及IgA1異常糖基化作用的影響±s)

a:P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較。

2.3 IL-17對B淋巴細胞分泌的IgA1糖基化的影響 在劑量依賴實驗中，采用HAA凝集素結合實驗檢測細胞上清液中IgA1的豐乳糖基轉移酶(GalNAc)結合凝集素的能力，OD值越高表示IgA1分子的低糖基化程度越高。結果顯示，與對照組比較，5 ng/mL的IL-17對IgA1分子的糖基化異常影響差異無統計學意義(P>0.05)，10～320 ng/mL的IL-17均可明顯促進IgA1的低糖基化(P<0.05)，在160 ng/mL時達到了峰值，隨后進一步提高IL-17濃度，IgA1的低糖基化反而出現一定程度的下調，見表1。在時間依賴實驗中，作者采用160 ng/mL的IL-17刺激B淋巴細胞培養24、48、72 h，每組與同一時間點的對照組比較，HAA凝集素結合實驗結果顯示，在24、48 h組上清液中IgA1的濃度均較同一時間點的對照組高(P<0.01)，但在72 h組上清液中IgA1的濃度與差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

3 討 論

IgAN是世界范圍內尤其是亞洲地區最常見的導致慢性腎衰竭的原發腎小球疾病之一。其發病涉及遺傳、免疫等多種復雜因素，機制尚未完全明了。IgAN病理是以系膜區IgA沉積為特征的系膜增生性腎小球腎炎，IgAN的始發因素是系膜區IgA的沉積，其主要為多聚IgA1(pIgA1)沉積，伴或不伴IgG、 IgC3沉積。眾多研究已證明IgAN患者血清、腎小球系膜區及尿液的循環免疫復合物中均存在異常糖基化IgA 分子[8-10]。

而引起低糖基化IgA1分子形成的原因主要是由于糖基化酶異常可產生N-乙酰半乳糖胺末端半乳糖基化通過細胞內半乳糖基轉移酶[主要是β-1,3 半乳糖基轉移酶(C1GALT1)]催化，且需其伴侶蛋白Cosmc的輔助，最終由唾液酸酶催化半乳糖唾液酸化形成糖鏈。研究發現在IgAN患者的PBMC、扁桃體組織及扁桃體B淋巴細胞中C1GALTl及其伴侶蛋白Cosmc的蛋白表達水平及基因表達水平都是降低的[11-13]。同時，扁桃體B淋巴細胞的C1GALTl基因表達水平和IgAN患者的臨床表現[如腎小球濾過率(GFR)、蛋白尿及組織損傷評分等]是顯著相關的[11]。在筆者的早期研究中也發現IgAN患者外周血中B淋巴細胞Cosmc mRNA表達水平顯著低于對照組，且與蛋白尿成負相關，提出IgAN患者lgAl O-糖基化異常可能是外周血B淋巴細胞Cosmc mRNA表達下降所致，外周血B淋巴細胞Cosmc mRNA表達下降可能是IgAN發病機制之一[14]。

IL-17是一種強大的前炎性細胞因子，也是炎性反應的微調因子，可促進中性粒細胞和單核細胞的募集，引起炎癥細胞浸潤和組織損傷，參與腎臟炎性反應的發生和發展[15]。筆者將IL-17刺激B淋巴細胞后發現，IL-17可促進B淋巴細胞的增殖且呈時間和劑量依賴性，并且在促進B淋巴細胞增生的同時還引起低糖基化異常的IgA1分泌增多。因此在IgAN患者的體內，產生糖基化異常的IgA1分泌增多的原因可能是由于外源性抗原如各種病毒、 幽門螺旋桿菌引起Th17細胞的分泌增多，導致IL-17分泌增加，從而引起B淋巴細胞增生及低糖基化異常的IgA1分泌增多，沉積到腎臟引起疾病的發生。

綜上所述，IL-17可誘導B淋巴細胞增殖，且作用隨濃度梯度而增加，大劑量有一定細胞抑制作用。IL-17能誘導B淋巴細胞分泌IgA1。IL-17呈時間和劑量依賴性誘導B淋巴細胞分泌低糖基化的IgA1。

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Effects of IL-17 in IgA nephropathy induced underglycosylation of IgA1

LinJiaru1,2,FanJunming1,2

(1.ClinicalCollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China；2.DepartmentofNephrology,theFirsAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,LuZhou,Sichuan646000,China)

inteleurin-17；glomerular nephlitis,IGA；B lymphocytes；glycosylation

林佳如(1988-)，在讀博士，主要從事IGA腎病發病機制以及中醫藥治療慢性腎臟病的相關研究。

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1671-8348(2016)28-3907-03

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