RNAi沉默ERCC1基因對肺腺癌細胞順鉑敏感性的影響

王巍煒，巫正偉，王德光，張 勇

(昆明醫科大學第三附屬醫院胸外科 650118)

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論著·基礎研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.005

RNAi沉默ERCC1基因對肺腺癌細胞順鉑敏感性的影響

王巍煒，巫正偉，王德光，張 勇△

(昆明醫科大學第三附屬醫院胸外科 650118)

[摘要] 目的 目的用包含切除修復交叉互補(ERCC1)基因特異 RNA 序列的慢病毒，將其轉染入宣威肺腺癌細胞XWCL05中，沉默ERCC1基因表達，初步探討其基因沉默效果及對順鉑敏感性的影響，為順鉑耐藥逆轉提供思路和依據。方法 經 293T 細胞包裝后構建ERCC1基因 RNAi 的慢病毒載體及陰性對照，分別使用XWCL05空白組(空白對照)、XWCL05-neg 組(轉染空載體)、XWCL05-RNAi 組(轉染 ERCC1-RNAi 慢病毒)。Western blot 法檢測轉染前后XWCL05 細胞中ERCC1 蛋白的表達。12.5 μg/mL 順鉑作用 48 h 后，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測順鉑對各組XWCL05細胞增殖抑制率的影響;流式細胞術檢測各組中XWCL05 細胞的凋亡率。結果 (1)Western blot 結果顯示，XWCL05-RNAi 組中 ERCC1蛋白表達水平顯著低于XWCL05-neg組(P<0.05)，而XWCL05-neg和XWCL05空白組差異無統計學意義(P>0.05)。(2)MTT法檢測顯示相同濃度順鉑作用下，XWCL05-RNAi組的增殖抑制率顯著高于XWCL05-neg組和XWCL05空白組(P<0.05)，而XWCL05-neg組。(3)流式細胞術檢測結果顯示，XWCL05-RNAi組凋亡率顯著高于XWCL05-neg組和XWCL05空白組(P<0.05)。而順鉑作用后，各組凋亡率較前均顯著升高(P<0．05)，且XWCL05-RNAi組凋亡率顯著高于其余兩組。結論 ERCC1基因 RNAi 的慢病毒能夠有效地沉默宣威肺腺癌細胞XWCL05中ERCC1基因的表達，并增強XWCL05對順鉑的敏感性。

遺傳載體；RNA 干擾；ERCC1；肺腺癌細胞

[Abstract] Objective RNAi targeted ERCC1 were used to transfected Xuanwei lung adenocarcinoma cell line XWCL05 by lentivirus in order to further investigate ERCC1 gene silencing effect on the cisplatinum sensitivity of XWCL05.We wish this could be reference for cisplatinum-resistance reversion.Methods Lentivirus contained ERCC1 targeted RNAi were cultured in 293T cell line and XWCL05 wild type(control),XWCL05-neg(blank vector)and XWCL05-RNAi(ERCC1-RNAi)were cultured for further analysis.Western blot was applied to test ERCC1 expression in XWCL05 before and after transfection.After co-cultured with cisplatinum(concentration 12.5 μg/mL)for 48 hours,MTT was used to test cell proliferation and flow cytometry(FCM)was used to test cell necrosis.Results (1)Western blot showed ERCC1 expression was significantly lower in XWCL05-RNAi(P<0.05) and its expression between XWCL05 wild type and XWCL05-neg showed no significantly difference(P>0.05).(2)In MTT test,there was significant proliferation inhibiting effect in XWCL05-RNAi group compared with XWCL05-neg group.(3)In FCM,the necrosis rate of XWCL05-RNAi was significantly higher(P<0.05)than that of other two groups and there was also no significant difference between XWCL05 wild type and XWCL05-neg.However after treated with cisplatinum,the necrosis rate of these 3 groups increased significantly when compared with their counterpart before the treatment of cisplatinum(P<0.05)and necrosis rate of XWCL05-RNAi decreased the most.Conclusion ERCC1 RNAi lentivirus can effectively silence ERCC1 gene expression in XWCL05 and enhance XWCL05 sensitivity to cispaltinum.

以鉑類聯合第3代化學治療藥物是肺癌的標準化學治療方案，但無論是初治還是復發的肺癌患者，均可能存在對鉑類藥物尤其是順鉑不同程度的耐藥，嚴重影響肺癌化學治療療效[1-4]。因此，如何避免或逆轉患者對順鉑耐藥是當前的研究熱點。DNA損傷修復能力增強是導致實體腫瘤對順鉑耐藥的主要原因。研究表明，DNA修復存在5種途徑：核苷酸切除修復(NER)、同源重組修復(HRR)、非同源末端連接(NHEJ)、堿基切除修復(BER)和錯配修復(MRR)。DNA損傷主要通過NER途徑修復，而切除修復交叉互補(ERCC1)基因在NER中起關鍵作用。因此，反向抑制ERCC1蛋白表達，可能會減弱DNA修復功能，增加肺癌細胞對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡。宣威地區是云南省乃至全國肺癌高發區之一，流行病學研究顯示其高發人群主要為農民，組織學分型以腺癌為主，女性患者比例高于男性。前期研究也發現宣威肺腺癌患者中ERCC1基因高表達[5]。慢病毒載體介導的RNA干擾(RNA interference，RNAi)是研究基因功能和細胞信號轉導的重要方法，可持續有效地抑制靶基因的表達。本研究通過構建ERCC1基因慢病毒干擾載體，將其轉導入宣威地區肺腺癌患者的癌細胞XWCL05中，探討其對ERCC1蛋白表達的作用和對順鉑敏感性的影響，以期為肺癌患者順鉑耐藥逆轉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 宣威肺腺癌細胞株XWLC-05，由昆明醫科大學第一附屬醫院建株，昆明醫科大學第三附屬醫院腫瘤研究所提供。工具細胞293T由昆明醫科大學第三附屬醫院腫瘤研究所提供。RPMI-1640培養液、胰蛋白酶、胎牛血清、Lipofectamine 2000試劑盒均購自XXLIFE公司。BCA蛋白質定量試劑盒、細胞及組織總蛋白抽提試劑盒、Western blot 試劑盒、HRP兔二抗等購自碧云天有限公司。其他試劑均為進口和國產分析純。

1.2 慢病毒包裝 利用公用網站按照RNA序列設計原則，設計多個RNA靶點序列，根據設計軟件進行評估測定，選擇最佳的動力學參數靶點進入后續實驗流程。由上海吉凱基因公司合成含干擾序列的雙鏈 DNA oilgo，其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切后的RNA干擾載體上。將連接好的產物轉入制備好的細菌感受態細胞，對長出的克隆進行PCR鑒定，測序比對正確的克隆即為構建成功的目的質粒。將編碼慢病毒顆粒的重組病毒顆粒及其兩種輔助包裝載體質粒分別進行高純度無內毒素抽提，按Lipofectamine 2000試劑盒使用說明進行共轉染293T細胞，轉染后按說明書進行培養，之后收集、濃縮富含慢病毒顆粒的細胞上清液，在293T細胞中測定并標定病毒滴度。制作完成慢病毒包裝產生的病毒液(ERCC1-RNAi-LV、ERCC1-negative-LV)由上海吉凱基因技術公司幫助合成包裝。

1.3 慢病毒轉染 將置于-80 ℃冰箱中保存的細胞株取出，培養、傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞分為XWCL05空白組(空白對照)、XWCL05-neg組(轉染空載體)、XWCL05-RNAi組(轉染 ERCC1-RNAi慢病毒)。感染前1 d，將XWLC05細胞接種于6孔板中，每孔接種細胞1×105，于37 ℃、5%CO2培養箱培養。24 h后，開始病毒感染，加入RPMI-1640培養液每瓶5 mL，再加入稀釋病毒液 100 μL(MOI值相當于10)，培養 6 h 后換液，繼續培養 72 h 后進行后續實驗。

1.4 Western blot檢測ERCC1蛋白表達 病毒感染3 d后，分別取感染后的各組細胞，提取總蛋白并測定蛋白質濃度，BCA試劑盒定量，5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液及蛋白裂解液將樣品濃度定為3 μg/μL。取 20 μg改為24 μg或8 μL蛋白質，與 2×SDS 上樣緩沖液1∶1混合，100 ℃變性10 min。置冰上 2 min，進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)膠電泳。電泳完畢后，切膠、轉膜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用 20 mL封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST)室溫孵育1 h，棄封閉液，分別加入ERCC1多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后洗膜，加入HRP標記的二抗(1∶4 000)孵育后洗膜。加入 ECL 化學發光顯色試劑，反應 5 min，X線片曝光后顯影、定影。以 β-actin 為內參。

1.5 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖抑制率 分別取對數生長期的XWCL05空白組、XWCL05-neg組、XWCL05-RNAi 組細胞，其中，XWCL05組為空白對照組。均以 6×104/mL接種于96孔板培養 24 h 至細胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度梯度的順鉑。本研究設置5個濃度梯度：3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/mL，每組均設5個復孔。37 ℃、5%CO2繼續培養48 h，每孔加入 20 μL MTT 溶液，繼續培養4 h后終止，除去孔內培養液。每孔加入 150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀測量490 nm波長處吸光度(OD)值；重復3次，腫瘤細胞抑制率=(1-實驗OD值/對照組OD值)×100%。

1.6 流式細胞檢測細胞凋亡情況 順鉑作用48 h后，將各組細胞用胰酶處理后懸浮，每組取至少1×106/mL細胞，以1 000 r/ min速度離心5 min，棄培養液。PBS 洗1遍，加入70%冷乙醇固定，4 ℃過夜。加入PI染色液I mL，置于4 ℃冰箱中避光染色，0.5 h后用流式細胞儀檢測，用相關軟件分析數據，計算凋亡細胞所占的百分比。檢測前先以人淋巴細胞作為標準品，調校儀器CV值在3.0%內。實驗重復 3 次。

2 結 果

2.1 轉染前后ERCC1蛋白表達情況 XWCL05組、XWCL05-neg組、XWCL05-RNAi組細胞中ERCC1蛋白的相對表達量分別為0.57±0.02、0.54±0.03、0.11±0.02。XWCL05-RNAi組細胞中ECRR1蛋白的相對表達量顯著低于其余兩組(P=0．00)，而XWCL-05空白組、XWCL05-neg 組差異無統計學意義(P=0.81)，見圖1。

1:XWCL05空白組；2:XWCL05-neg 組；3:XWCL05-RNAi 組。

圖1 RNAi轉染對ERCC1蛋白表達的影響

2.2 RNAi轉染對順鉑藥物敏感性的影響 MTT法測定順鉑細胞毒作用分析顯示，XWCL05-neg組細胞對順鉑的IC50為(14.21±3.72)μg/mL，而XWCL05-RNAi組細胞對順鉑的IC50為(5.93±2.76)μg/mL;在一定范圍內，相同濃度順鉑作用下XWCL05-RNAi 組的增殖抑制率顯著高于XWCL05-neg 組，見圖2。

圖2 RNAi轉染對DDP藥物敏感性的影響

2.3 RNAi轉染對細胞凋亡率的影響 流式細胞術檢測XWCL05空白組、XWCL05-neg組和XWCL05-RNAi組的細胞凋亡率分別為(1.81±0.31)%、(1.73±0.42)%和(16.04±3.62)%，XWCL05-RNAi組凋亡率高于其余兩組，差異有統計學意義(P<0.05)，XWCL05-neg組和XWCL05空白組凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。而當用12.5 μg/mL 順鉑作用48 h后，XWCL05空白組、XWCL05-neg組和XWCL05-RNAi組的細胞凋亡率分別為(47.00±3.61)%、(51.00±3.43)%和(81.2±4.33)%，可見順鉑作用后，各組凋亡率均顯著升高(P<0.05)，XWCL05-RNAi組凋亡率高于其余兩組，差異有統計學意義(P=0.00)。

3 討 論

鉑類聯合第3代化學治療藥物一直是肺癌化學治療的標準方案，有著極其廣泛的應用[6]。如何提高鉑類藥物敏感性，減少耐藥已經成為臨床研究的熱點。鉑類藥物的細胞毒作用主要是形成鉑-DNA加合物，抑制DNA復制及轉錄，導致DNA斷裂和錯誤編碼從而引起細胞死亡，因此當DNA損傷修復能力增強時，機體即會對順鉑產生耐藥性[7]。前期研究表明ERCC1的表達產物與ERCC4(XPF)形成雜合二聚體ERCC1-XPF，該二聚體是一個特異性的連結5′端的核酸內切酶，具有損傷識別和切除5′端的雙重作用，在NER中起到限速或調節的重要作用。ERCC1高表達的情況下，腫瘤細胞修復順鉑造成的損傷的功能可能增強。多項臨床研究中也發現，在ERCC1高表達的肺癌患者中采用鉑類方案進行化學治療，其近期療效和遠期效果都欠佳[8-10]。同時，近期研究發現，ERCC1基因異構體[11]的存在及人群中ERCC1基因的多態性[12]，使得ERCC1導致的鉑類耐藥更加復雜。RNAi技術是利用雙鏈RNA高效、特異性地降解細胞內同源信使RNA(messenger RNA，mRNA)，從而阻斷特定基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型。采用RNAi技術可減少腫瘤耐藥性，增加腫瘤對放、化療藥物的敏感性，這在其他腫瘤細胞的相關實驗研究中也得到了證實[13-15]。

本研究采用ERCC1表達較高的宣威肺腺癌細胞株XWCL05，構建ERCC1干擾基因,通過慢病毒載體將其轉導入XWCL05，結果顯示XWCL05-RNAi 組細胞中ERCC1蛋白的相對表達量明顯低于XWCL05組和XWCL05-neg組，說明通過RNAi干擾XWCL05中ERCC1基因的表達，在細胞層面上是切實可行的。在本研究中，筆者發現，ERCC1表達被干擾后，宣威肺腺癌細胞株XWCL05的IC50濃度明顯降低，說明通過抑制ERCC1表達能夠明顯提高XWCL05對順鉑藥物的敏感性。流式細胞檢測顯示，通過單用XWCL05-RNAi病毒或順鉑給藥都能促進宣威肺腺癌細胞株XWCL05凋亡，且在XWCL05-RNAi病毒聯合順鉑的組別中，其凋亡更為明顯，提示在細胞層面，通過有效的RNAi轉染能夠提高宣威肺腺癌細胞XWCLO5對順鉑的敏感性。

綜上所述，采用RNAi干擾技術能夠有效地沉默肺癌細胞系中ERCC1的表達，提高肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。這一發現為肺癌治療提供了新思路，也為肺腺癌鉑類耐藥機制的認識提供了新的視角。

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The effect of RNAi silencing ERCC1 gene on the cisplatinum sensitivity of lung adenocarcinoma cell line*

WangWeiwei,WuZhengwei,WangDeguang,ZhangYong△

(DepartmentofThoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming,Yunnan650118,China)

genetic vector；RNA interference；ERCC1；lung adenocarcinoma cell

云南省科技廳-昆明醫科大學2013年聯合基金資助項目(2013FB164)；昆明醫科大學第三附屬醫院博士基金資助項目(BS55201510)。 作者簡介：王巍煒(1979-)，副教授，博士，主要從事肺癌的多學科綜合治療研究。△

R453.9

A

1671-8348(2016)28-3904-03

2016-06-18

2016-07-06)