亞慢性暴露壬基酚誘發(fā)大鼠非酒精性脂肪肝的研究

楊雪松，俞 捷,楊雪峰，羅 婭，楊 靜,李克彬,許 潔△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義 563099)

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·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.004

亞慢性暴露壬基酚誘發(fā)大鼠非酒精性脂肪肝的研究

楊雪松1，俞 捷1,楊雪峰2，羅 婭1，楊 靜1,李克彬1,許 潔1△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，遵義 563099)

[摘 要] 目的 探討連續(xù)90 d灌胃壬基酚(NP)能否誘發(fā)非酒精性脂肪肝(NAFLD)。方法 48只雄性SD大鼠分成4組，即對照組，低、中、高劑量組，NP劑量分別為0、20、60、180 mg·kg-1·d-1,每組平均分為常規(guī)飲食、高脂飲食兩個亞組。空腹灌胃NP 90 d，期間每周稱量1次體質(zhì)量，第60天行肝臟彩超觀察。第90天全自動生化分析儀檢測肝功、血脂，高效液相色譜儀檢測肝臟中NP的濃度。結(jié)果 各劑量常規(guī)飲食組與對照組比較，低、中、高劑量組三酰甘油(TG)降低(P>0.05)，天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高(P<0.05)，低、高劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)降低(P<0.05)，低密度脂蛋白(LDL)減低(P<0.05)，對照組及低、中劑量組未出現(xiàn)脂肪肝，高劑量組1/2的動物出現(xiàn)脂肪肝。各劑量高脂飲食組與對照比較，低、中、高劑量組、TG升高(P<0.05)，ALT降低(P<0.05)，AST升高(P<0.05)，HDL升高(P<0.05)，高劑量組總膽固醇(TC)升高(P<0.05)，高脂飲食組被選部分動物中，低、中劑量組1/2的動物出現(xiàn)了脂肪肝，高劑量組則全部出現(xiàn)脂肪肝病變。與對照組比較，低、中、高劑量組大鼠肝臟NP濃度升高(P<0.05)，肝臟NP濃度與染毒劑量的存在秩相關(guān)rs常規(guī)飲食=0.942,rs高脂飲食=0.481(P<0.05)。結(jié)論 亞慢性染暴露NP是導(dǎo)致NAFLD的危險因素之一，增加了NAFLD的發(fā)病風(fēng)險。

壬基酚；非酒精性脂肪肝；常規(guī)飲食；高脂高糖飲食

[Abstract] Objective To explore whether expose to nonyphenol(NP)can induce non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in rats,subchronically.Methods Totally 48 male SD rats were randomly divided into 4 groups,namely,control,low,middle,and high dose group,the doses were 0,20,60,180 mg·kg-1·d-1,each group was divided into normal diet and night fat diet equally.The rats were intragastric administration of NP 90 d,weights of rats were examined once a week,on the 60th day ,livers were detected by colored type-B ultrasonic.On the 90th day,liver function and blood fat were tested by automatic biochemistry analyzer,content of liver's nonyphenol examed by high performance liquid chromatograph.Results In normal diet,compare with control group,low,middle and high dose group of glycerol triglyceride(TG) was decreased(P<0.05),aspartate amino shift enzyme(AST) increased in middle and high groups(P<0.05),alanine transfer enzyme(ALT)decreased(F=12.973,P<0.05)in low and high group,low density lipoprotein(LDL)decreased(P<0.05).In normal diet,there was no occurrence of NAFLD in control,low and middle groups,but a half of animals were suffered from NAFLD.In the high fat diet,compared with control group,ALT was decreased in low,middle and high dose(P<0.05),AST was rose(P<0.05)and TG was increased(F=2.979,P<0.05);in high dose group,the total cholesterol(TC) was increased(P<0.05),in low dose group and middle dose group,HDL was increased(P<0.05).In some selected animals of the high fat diet group,half of the animals in the low and middle dose groups occurred NAFLD,while in high dose group all occurred NAFLD.Compared with the control group,concentration of NP in rat liver were increased in treatment gounp(P<0.05),NP concentration and the exposure dose exit rank correlation coefficient(rsnormal diet=0.942,rshigh dose=0.481;P<0.05).Conclusion Exposure to NP is one of the risk factors which leading to NAFLD,subchronically,which increases the risk of NAFLD.

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1]。目前發(fā)病逐年上升，一般人群發(fā)病率為10.3%[2],肥胖人群發(fā)病率達到75.0%，而且隨生活方式的改變還在上升[3],肥胖程度越高，患NAFLD的可能性越大[4]，NAFLD的患病在發(fā)達國家超過30%而且仍然在持續(xù)上升[5]。據(jù)估計，當(dāng)前有大約10億人患有不同形式的脂肪肝[6]，目前研究報道NAFLD的發(fā)病原因，除了與肥胖，2型糖尿病，胰島素抵抗，藥物所致的肝損傷有關(guān)[7]，環(huán)境因素也越來越受到重視。壬基酚(nonylphenol,NP)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)，它是烷基酚聚氧乙烯醚的最終降解產(chǎn)物，被廣泛用于潤滑油添加劑、樹脂、塑化劑、表面活化劑、涂料、化妝品和其他配方產(chǎn)品的制備[8]。目前我國每年的NP產(chǎn)量是50 000噸，由于大量應(yīng)用，在非職業(yè)暴露人群脂肪組織或血清中均檢測出NP[9]。近年來眾多流行病學(xué)和動物實驗研究表明，EEDs暴露與不斷增加的NAFLD發(fā)病率有關(guān),還一些流行病數(shù)據(jù)暗示EEDs與人類健康的有害結(jié)局相關(guān)[10]。但是揭示EEDs對人類健康潛在影響的流行病資料非常少，因此，需要更多深入的人群調(diào)查[11-13]。人類主要通過飲水和食物暴露NP，但是目前關(guān)于NP暴露能否誘發(fā)NAFLD未見報道。本研究首次通過連續(xù)90 d灌胃染毒觀察NP對NAFLD發(fā)生是否具有作用。為進一步研究NAFLD發(fā)病機制提供初步指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 48只SPF級雄性SD大鼠購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪動物中心，合格證號為SCXK(渝)2012-0005,分為對照組、低、中、高劑量組(0,20,60,180 mg·kg-1·d-1)。常規(guī)飲食亞組(C、L、M、H)喂養(yǎng)普通飼料(100%基礎(chǔ)飼料)，高脂飲食亞組(CH、LH、MH、HH)給予高脂高糖飼料(15%豬油，20%白糖，65%基礎(chǔ)飼料)。NP溶于玉米油中，每天清晨7:00～9:00點空腹灌胃90 d，每次灌胃1 h內(nèi)完成。即對照組只灌玉米油，其余3組灌含NP的油溶劑，灌胃體積為10 mL/kg-1·d-1。試驗動物飼養(yǎng)于空調(diào)(格力)控溫的動物房，維持環(huán)境溫度(20±2)℃、相對濕度為(60±5)%。按8 g/100 g體質(zhì)量給予干飼料，自由飲水，黑暗/光照每12小時交替1次。

1.2 主要試劑與儀器 純度99%NP(日本東京化成株試會社集團有限責(zé)任公司)，玉米油(山東魯花集團有限責(zé)任公司)，全自動分化分析儀(貝克庫爾曼特)，低速離心機(Eppendorf公司),多普勒彩色B超(Phlips)，高效液相色譜儀(Aligent 1100,USA)。

1.3 方法 (1)體質(zhì)量、B超：染毒期間每周稱量1次體質(zhì)量，注意體質(zhì)量變化。第60天每個亞組取2只大鼠行肝臟彩超，判斷有無脂肪肝形成。(2)肝體指數(shù)(肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)、脂體指數(shù)(脂質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)：剖殺動物前稱量體質(zhì)量用以計算肝體指數(shù)、脂體指數(shù)。取血后，完整取下肝臟，肉眼觀察，生理鹽水浸洗血液，濾紙吸干表面水分，稱濕質(zhì)量，計算肝體指數(shù)。取睪丸、附睪旁脂肪，稱質(zhì)量，計算脂體指數(shù)。(3)肝功、血脂：第90天7%水合氯醛麻醉(0.5～0.8 mL每100 g體質(zhì)量)大鼠。所有血樣2 h內(nèi)4 000 r/min離心10 min后取上清液上機檢測，全自動生化分析儀按使用指南操作。(4)高效液相色譜法測肝臟中NP,取0.5 g組織置于具塞玻璃管中，加入正己烷-乙醚混合物(V正∶V乙=7∶3)4 mL,手持勻漿機20 000 r/min勻漿5～10 s，4 000 r/min離心10 min，取上清液到另一潔凈玻璃管中，50 ℃水浴蒸干，加入0.5 mL乙腈溶解過濾后全部移至上樣瓶上機檢測。色譜條件：色譜柱(ECLIPSE XD8-C18、150 mm×460 mm、5 μm,Agilent,USA)，流動相(乙腈與0.1%冰乙酸混合物，體積比=85∶15)，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL,激發(fā)波長275 nm,發(fā)射波長312 nm。FLD檢測器。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，對多組計量資料做方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義后再用SNK法進行兩兩比較。兩非正態(tài)變量做Spearman相關(guān)，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組體質(zhì)量變化趨勢 每組大鼠平均體質(zhì)量呈先上升再減低然后持續(xù)上升最后下降的總趨勢(圖1)。以12次稱量的平均體質(zhì)量表示，常規(guī)飲食組中，隨染毒劑量增加體質(zhì)量減輕(P<0.05)。高脂飲食中，LH、MH、HH組與CH組比較，體質(zhì)量略下降,僅LH組與CH組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 高劑量組體質(zhì)量動態(tài)變化

2.2 肝質(zhì)量、肝體指數(shù)及脂肪質(zhì)量、脂體指數(shù)比較 第90天大鼠開腹后肉眼觀察肝臟，常規(guī)飼料組肝臟邊緣薄，赤褐色，與C組比較無明顯肉眼可見區(qū)別，M組與C組比較肝體指數(shù)有差異(P<0.05)，H組與C組比較脂體指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高脂飼料組，相同染毒劑量肝臟體積普遍比常規(guī)飼料組大，包膜緊張，邊緣鈍，切面觸之有油膩感，散在點狀或小片狀淡黃色區(qū)域布于肝臟表面，但是LH、MH、HH組與CH組比較無肉眼可見差別,肝體指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)、脂體指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種飲食肝體指數(shù)、脂體指數(shù)±s,%)

2.3 肝臟中NP濃度 常規(guī)飼料組和高脂飼料組，與各自對照組比較，低、中、高劑量組大鼠肝臟NP濃度升高(P<0.05)，肝臟NP濃度與染毒劑量秩相關(guān)系數(shù)rs普=0.942,rs高=0.481(P<0.05)，見表2。

表2 不同飲食肝臟NP濃度

2.4 肝臟彩超 肝臟大小以肝斜徑表示，普通飼料組各自組和高膙脂飲食組各自組組間未出現(xiàn)明顯差異，但相同劑量高脂組大于常規(guī)飼料組。整個肝區(qū)回聲均勻，無強回聲區(qū)。即普通飼料組無B超所見脂肪肝變性，高脂飲食組肝臟出現(xiàn)強回聲結(jié)節(jié)，提示有脂肪肝形成,見圖2。

A：普通飲食組；B：高脂飲食組。

圖2 高脂飲食與普通飲食肝臟超聲比較

2.5 肝功和血脂 常規(guī)飲食組中各NP劑量組與C組比較，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)降低，M、H組天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高，總膽固醇(TC)升高。低密度脂蛋白(LDL)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3；對照組，低、中劑量組未出現(xiàn)脂肪肝，高劑量組1/2的動物出現(xiàn)脂肪肝。高脂高糖飲食組，ALT隨染毒劑量上升逐漸下降；與CH組、ALT降低比較，AST升高，LDL升高，HH組TC升高，見表4；高脂飲食組被選部分動物中，低、中劑量組1/2的動物出現(xiàn)了脂肪肝，高劑量組則全部出現(xiàn)脂肪肝病變。

表3 常規(guī)飲食組各亞組肝功、血脂數(shù)值±s)

表4 高脂飲食組各亞組飲食肝功、血脂數(shù)值±s)

3 討 論

NP是一種代表性的EEDs，具有擬雌激素作用，能夠競爭性與體內(nèi)部分雌激素受體結(jié)合，從而影響體內(nèi)正常的激素代謝[14]，其中胰島素抵抗可能與此有關(guān)。本實驗為模擬人攝入NP的方式，采取灌胃法對實驗動物染毒，考慮人群中男性NAFLD患病率較高[2]，前期主要研究NP的擬雌激素樣作用干擾男性體內(nèi)激素平衡從而影響機體健康，故全部選擇雄性大鼠進行實驗。目前NAFLD的發(fā)病機制尚不完全明了，大多數(shù)學(xué)者普遍接受的是“二次打擊”學(xué)說。即：第1次打擊主要是胰島素抵抗，引起良性的肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積；第2次打擊主要是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，此為疾病進展的關(guān)鍵。氧化應(yīng)激狀態(tài)是指活性氧(ROS)及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生超過機體的防御和去毒能力，使促氧化物和抗氧化物之間的動態(tài)平衡失調(diào)。此外，肥胖、2型糖尿病、高脂血癥單獨或共同成為NAFLD的易感因素[1]，本實驗中各組大鼠體質(zhì)量的均數(shù)變化成先增加再減低然后持續(xù)上升最后減低的總趨勢。大鼠第1次體質(zhì)量上升為適應(yīng)性喂養(yǎng)階段的正常體質(zhì)量上升，此期體質(zhì)量上升較快，說明飼養(yǎng)境及氣象條件適宜，大鼠適應(yīng)能力較強，此環(huán)境可以滿足試驗動物的飼養(yǎng)要求。自第2周起，體質(zhì)量開始迅速短暫下降，是灌胃引起的不適導(dǎo)致進食量迅速下降引起的。在這階段后1周，試驗大鼠體質(zhì)量開始長時間持續(xù)上升，且增長平穩(wěn)，增長曲線斜率比適應(yīng)性喂養(yǎng)略低。說明動物對灌胃刺激適應(yīng)期已過，并且逐漸適應(yīng)灌胃，和灌胃者熟悉程度增加也有關(guān)系。但是為何斜率會低于第1周，是因為體質(zhì)量增長速度低于適應(yīng)性喂養(yǎng)階段，可能的是毒效應(yīng)已經(jīng)開始對體質(zhì)量產(chǎn)生影響。最后階段，體質(zhì)量持續(xù)緩慢下降，在8周時體重開始下降說明，此期可能是大鼠機體與毒物在進行一個相互斗爭的過程，說明毒物已對大鼠造成嚴重不可逆損害，機體不能適應(yīng)和完全清除毒物，超過其耐受程度，由毒物蓄積轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄罘e。肝臟中NP濃度隨染毒劑量的上升而升高，表明肝臟是NP的貯存庫之一，這與范奇元等[15]的研究一致，且說明肝臟不能對20 mg·kg-1·d-1染毒進行消除，此劑量能對動物造成不可逆性的損傷。這與文獻報道的NP的無可見有害怕作用水平(NOAEL)為10 mg·kg-1·d-1一致。肝內(nèi)NP檢測結(jié)果顯示，兩對照組肝內(nèi)也有少量NP檢出，這可能是飼料和飲水中含有微量的NP所致，筆者將在以后進一步的實驗中進行改進。此外，作者發(fā)現(xiàn)，除中劑量組外，高脂飲食組肝臟內(nèi)NP濃度高于相同染毒常規(guī)飲食組。這與高脂飲食組出現(xiàn)脂肪肝，NP具有較高的脂溶性有關(guān)。肝臟B超顯示普通飼料組未見回聲增強區(qū)域，表明大鼠無明顯的脂肪肝變性改變，說明高劑量(180 mg·kg-1·d-1)誘發(fā)了NAFLD。高脂飲食組幾乎都出現(xiàn)了嚴重的脂肪肝病變，且LH、MH組1/2被檢動物出現(xiàn)了脂肪肝，HH組則全部出現(xiàn)了脂肪肝。說明高脂高糖飲食誘導(dǎo)脂肪肝是可取的方法，NP可以升高實驗動物患NAFLD的比例。后期筆者們將從肝臟的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、脂質(zhì)代謝通路去探索NP誘發(fā)NAFLD的發(fā)病機制，為該病的預(yù)防提供指導(dǎo)。一般情況下，NAFLD會致ALT升高，但本次研究中，ALT呈下降趨勢，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，較為反常。這種現(xiàn)象是因為肝臟損害嚴重的“膽酶分離”現(xiàn)象造成還是有其他原因需要進一步研究證實。然而AST卻是上升的，與對照組比較差異同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AST主要存在與細胞核中，這說明毒物對肝細胞的損傷已經(jīng)累及到細胞核，肝臟細胞損害嚴重。另外，較對照組，LDL呈下降趨勢，說明NP染毒影響了LDL的合成或分泌。間接地導(dǎo)致TG運出肝臟減少，使得TG較多沉積于肝臟，為脂肪肝的形成提供了先決條件。

綜上所述，高脂高糖飲食誘導(dǎo)脂肪肝模型成功率高。亞慢性暴露NP是NAFLD的發(fā)病危險因素，對NAFLD的發(fā)生、發(fā)展有作用。

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Study of non-alcoholic fatty liver disease in rats induced by nonylphenol subchronic exposure*

YangXuesong1,YuJie1,YangXuefeng2,LuoYa1,YangJing1,LiKebin1,XuJie1△

(1.SchoolofPublicHealth,ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563000,China；2.DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563099，China)

nonylphenol；non-alcoholic fatty liver；normal diet;high fat diet

國家自然科學(xué)基金資助項目(201360439，81560527)；貴州省教育廳青年基金資助項目(黔教合KY字[2013]198)；貴州省衛(wèi)生廳基金資助項目(gzwkj20131127)；遵義醫(yī)學(xué)院招標基金資助項目(2013F-68)；貴州省科技廳基金資助項目(黔科合LH字[2014]7543，黔科合J字[2014]2177號，[2014]2185號)；遵義醫(yī)學(xué)院研究生社會實踐基金資助項目(ysh-2015-001)。作者簡介：楊雪松(1989-)，在讀碩士,主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。△

R114

A

1671-8348(2016)28-3900-04

2016-06-18

2016-07-06)