MIS后病灶區灌注RSG對家兔ICH模型血腫周圍繼發性腦損傷的作用

任思穎，楊 勤,伍國鋒△，張 艷，李 軍

(1.貴州醫科大學附屬醫院急診醫學科，貴陽 550004；2.貴州醫科大學病理生理學教研室，貴陽 550000)

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MIS后病灶區灌注RSG對家兔ICH模型血腫周圍繼發性腦損傷的作用

任思穎1，楊 勤2,伍國鋒1△，張 艷1，李 軍1

(1.貴州醫科大學附屬醫院急診醫學科，貴陽 550004；2.貴州醫科大學病理生理學教研室，貴陽 550000)

[摘要] 目的 探討立體定向微創顱內血腫清除術(MIS)后病灶區灌注羅格列酮(RSG)對家兔腦出血(ICH)模型血腫周圍繼發性腦損傷的作用。方法 60只家兔分為4組，分別為模型對照組(MC組)、羅格列酮組(RSG組)、微創手術組(MIS組)和微創手術+羅格列酮組(MIS+RSG組)。各組家兔均制作ICH模型，MC組及RSG組在模型制作成功后6 h模擬手術過程進行假性血腫清除，RSG組病灶區灌注RSG，MIS組及MIS+RSG組進行微創血腫清除，MIS+RSG組隨后病灶區灌注RSG，于實施相關處理后第7天對各組家兔進行神經功能缺損(Purdy)評分并處死，取血腫周圍腦組織檢測過氧化物酶體增殖物激或受體γ(PPARγ)水平及血腦屏障(BBB)通透性。結果 MC組Purdy評分、BBB通透性明顯高于其他組，提示顱內血腫損害神經功能并破壞BBB通透性；與MC組相比，RSG組及MIS+RSG組的PPARγ表達顯著增加，而MIS組PPARγ表達減少，提示RSG能明顯增加PPARγ的表達，而微創清除顱內血腫后則可減少PPARγ的產生；與MC組比較，RSG組及MIS組血腫周圍伊文思藍(EB)水平顯著降低，提示RSG治療及MIS均可降低BBB通透性，MIS+RSG組EB含量降低更為明顯，提示MIS后病灶區灌注RSG降低BBB通透性的效果更加明顯。結論 MIS后病灶區灌注PPARγ激動劑RSG能有效減少家兔ICH模型繼發性腦組織損傷，改善神經功能。

腦出血；羅格列酮；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；血性，硬膜外，顱內；血腦屏障;繼發性腦損傷

2.DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUnivesity,Guiyang,Guizhou550000,China)

[Abstract] Objective To observe the effects of rosiglitazone(RSG)infusion therapy following minimal invasive surgery(MIS)for intracerebral hemorrhage(ICH)evacuation on perihematomal secondary brain injury in rabbits.Methods A total of 60 rabbits were randomly assigned to a model control group(MC group),a RSG medication group(RSG group),a minimally invasive surgery group(MIS group)and a MIS combined with RSG group(MIS+RSG group).An ICH was induced in all rabbits.The MC group and the RSG group just received a sham minimally invasive procedures at 6 h after the ICH model was prepared successfully.The RSG group perfused RSG to the perihematomal brain tissues.A MIS was performed in the MIS group and the MIS+RSG group.RSG infusion therapy following MIS in the MIS+RSG group.All rabbits were killed on the 7th d after the relative processes were performed successfully.Neurological deficit scores were determined,and the perihematomal brain tissues were obtained to determine the PPARγ and the blood-brain barrier(BBB)permeability.Results The neurological deficit scores,the BBB permeability were increased in the MC group when compared to the other groups,these results showed that the ICH disrupted BBB and damaged neurological function.The PPARγ were all significantly increased in the RSG group and the MIS+RSG group,but decreased in the MIS group compared with the MC group,these results showed that RSG could increased in the expression of the PPARγ levels but decreased after MIS for ICH.The Evan′s Blue(EB)were decreased in the RSG group and the MIS group compared with the MC group which means RSG medication and the MIS could decreased the BBB permeability.The MIS+RSG group had a remarkable results.The MIS+RSG group displayed a great decrease in BBB permeability.Conclusion Performing the MIS followed by PPARγ agonist RSG might be more efficacious for reducing secondary brain injury and improving the neurological function for ICH model in rabbits.

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)引起的腦損傷分為兩個階段。第一階段為0～4 h內，主要為血腫引起的機械性損傷,血腫擠壓周圍神經元和膠質細胞導致細胞死亡。第二階段為4 h至7 d，主要為血腫引起的繼發性腦損傷,紅細胞(RBC)滲入腦組織,裂解釋放細胞毒性物質引起炎性反應和氧化應激損傷[1-2]。微創血腫清除術(minimal invasive surgery，MIS)能有效清除血腫,降低血腫機械性壓迫引起的腦損傷[3-5]，但很難清除滲入血腫周圍腦組織的RBC及其裂解產生的細胞毒性物質，治療ICH引起的繼發性腦損傷程度有限。據此推論，MIS后血腫區灌注能增強小膠質細胞/吞噬細胞吞噬能力的藥物有可能是一種值得探討的治療方案[1,6]。Wu等[4]的研究表明，實施MIS的最佳時間窗是ICH后6 h左右。這正是血腫引起繼發性腦損傷的開始階段。清除血腫及滲入血腫周圍腦組織的RBC及其裂解產生的細胞毒性物質能有效減少炎性反應及繼發性腦損傷[1]。

在激活小膠質細胞/巨噬細胞和降低氧化應激方面，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通過轉錄水平的調控上調細胞表面清道夫受體CD36，從而幫助小膠質細胞/巨噬細胞通過吞噬或內吞來清除壞死或凋亡細胞殘骸[6-7]。

羅格列酮(RSG)是PPARγ的高親和性激動劑[8]，Zhao等[7]報道RSG促進大鼠ICH血腫分解，減少神經細胞損害，促進神經功能恢復，提出RSG通過PPARγ激活小膠質細胞/巨噬細胞可作為治療ICH的一個靶點。Wu等[5]報道ICH后金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)表達增加，在血腦屏障(BBB)損害中起重要作用，MIS可以減少MMP-9的表達，降低BBB通透性，RSG則通過PPARγ下調MMP-9的表達[9]，減少BBB通透性,均有助于減少ICH后繼發性腦損傷。

本研究以家兔神經功能評分、血腫周圍腦組織PPARγ水平及BBB通透性為指標，觀察MIS后病灶區灌注RSG對家兔ICH模型血腫周圍繼發性腦損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol試劑、Tris-HCl、乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)、熒光PCR試劑盒(上海Sangong生物技術有限公司)；甲酰胺(重慶化學試劑廠)；伊文思藍(EB,北京恒業中原化工公司)；4%多聚甲醛(武漢博士德生物科技公司)；尿激酶(廣東Livzon制藥有限公司)。

1.2 主要儀器 ZH-藍星B型兔腦立體定位儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)；電子天平(德國Satourious)；彩虹-722型光柵分光光度計(山東高密彩虹分析儀器)；5415 R高速離心機(賀利氏公司)；DK系列數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；MDF-382E型-80 ℃超低溫冰箱(美國佛羅里達州Harris公司)；Step One型熒光定量PCR儀(美國加州ABI公司)。

1.3 實驗動物分組 本研究得到貴州醫科大學實驗動物倫理委員會的批準。健康雄性家兔60只(體質量2.8～3.4 kg)，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。分為模型對照組(MC組，n=15)、羅格列酮組(RSG組，n=15)，微創手術組(MIS組，n=15)和微創手術+羅格列酮組(MIS+RSG組，n=15)。

1.4 家兔腦出血模型的建立 家兔ICH模型的制作參照文獻[3-5]。耳緣靜脈注射20%氨甲基酸乙酯(1 mL/kg)麻醉家兔后固定于兔腦定位儀上，顱頂脫毛并用碘伏消毒手術區域。切開皮膚分離至骨膜，暴露前囟和人字形骨縫，于AP：1 mm，L：6 mm處鉆孔。從耳中動脈取自體血(不抗凝)，用7號針頭緩慢注射0.3 mL血液到家兔腦基底節區(12 mm深處)。注血時間持續3 min，針頭置于原位8 min以防止血液回流，緩慢拔出針頭。肌內注射青霉素(40萬U)防止感染。3 h后進行兔腦CT掃描，如基底節區出現高密度影而側腦室無高密度影則表明ICH模型制作成功(圖1A)。排除標準為血液沿針道反流、血液進入側腦室及家兔死亡。

1.5 MIS清除血腫 模型制作成功后6 h再次麻醉家兔，固定在兔腦立體定位儀上，7號針頭沿制模時的針道插入血腫位置，通過負壓輕吸出部分血腫，再在血腫位置注入5 000 U尿激酶(溶于0.1 mL生理鹽水中)，針頭置于原位1 h后緩慢抽吸。MC組及RSG組模擬MIS過程,但不清除血腫也不注入尿激酶。MC組注入0.1 mL生理鹽水；RSG組血腫區灌注RSG 0.5 mg(溶于0.1 mL生理鹽水中)；MIS組MIS后血腫區灌注等量生理鹽水；MIS+RSG組在MIS后血腫區灌注RSG 0.5 mg(溶于0.1 mL生理鹽水中)。針頭均保持原位15 min后緩慢拔出。所有家兔均肌肉注射青霉素(40萬U)預防感染。

A：箭頭所示高密度影為顱內血腫；B：箭頭所示血腫已基本清除。

圖1 頭顱CT顯示MIS前后顱內血腫變化情況

1.6 腦組織標本的制備 各組家兔在實施相關處理后第7天處死。處死前2 h耳緣靜脈注射2% EB(2 mL/kg)，2 h后麻醉家兔，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳上剪一小口作出口，快速灌注生理鹽水2 000 mL直至流出液變清亮，再換4%的多聚甲醛1 000 mL快速灌注，該過程約需30 min。迅速斷頭取腦，置于冰盤，以針道為中心，切取血腫周圍約0.5 cm范圍內腦組織，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.7 觀察指標

1.7.1 血腫體積評估 家兔處死前2 h再次行頭顱CT掃描評估MIS效果。血腫量用Tada公式計算：[π/6×血腫長度(mm)×血腫寬度(mm)×血腫高度(mm)]。

1.7.2 神經功能缺損(Purdy)評分[10]第7天對各組家兔神經功能缺損情況進行評分，用Purcly評分的方法對家兔進行意識、行為、轉頭、轉圈、偏盲等情況進行評分。最高分為2分，為完全正常；最低分為11分，為動物死亡或意識完全喪失。運動功能 1～4分，意識清醒1～4分，轉頭0～1分，轉圈0～1分，偏盲0～1分。

1.7.3 實時熒光定量PCR(real time-PCR)檢測PPARγ mRNA 在家兔腦組織中的表達 采用Trizol試劑一步法提取腦組織總RNA，然后利用Superscript Ⅱ反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。引物用Primer5程序設計，序列如下：PPARγ引物正向5′-TTG TGA GCC TTG ACT TGA ACG ACC-3′、反向5′-CAT GAA GCC TTG TCC CTC CGA TA-3′。Tm(℃)75.29 ℃，擴增長度128 bp，β-actin引物正向5′-AGA TCG TGC GGG ACA TCA AG-3′,反向5′-CAG GAA GGA GGG CTG GAA GA-3′。Tm(℃)84.42 ℃，擴增長度181 bp。根據公式2-△△Ct計算出2-△△Ct值，用于檢測PPARγmRNA相對表達量，2-△△Ct值反映了樣本mRNA與內參基因β-actin mRNA的差異。

表1 各組家兔ICH模型MIS及RSG治療后PPARγ mRNA、BBB通透性及Purdy評分的變化

1.7.4 BBB通透性 BBB通透性通過EB作為追蹤劑來評價。各組家兔于處死前2 h經耳緣靜脈將2%EB溶液(2 mL/kg)注入家兔血液中,2 h后按照腦組織標本制備方法快速斷頭取腦，取血腫周邊組織并稱質量(精確到0.1 mg)，置于盛3 mL甲酰胺的測試管中,使用甲酰胺方法測量腦組織EB含量來衡量BBB破壞的嚴重程度。公式如下：腦組織EB水平(μg/g，濕質量)=B×甲酰胺(mL)/濕質量(g)，B指根據標準曲線的線性回歸方程得出的樣本EB水平(μg/mL)。

2 結 果

2.1 血腫體積評估 MIS術前各組家兔顱內血腫量無顯著差異，術后3 d復查頭顱CT提示MIS后家兔顱內血腫量明顯減少，MIS組及MIS+RSG組與MC組及RSG組比較差異有統計學意義(圖1B)，血腫量變化與筆者先前發表的論文類似[4]。

2.2 Purdy評分 MC組神經功能缺損明顯，MIS組及MIS+RSG組與MC組相比，Purdy評分顯著減少，見表1，表明MIS后神經功能有所改善，而MIS+RSG組改善更加明顯。

2.3 家兔血腫周圍腦組組PPARγ mRNA表達 與MC組相比，RSG組及MIS+RSG組的PPARγ mRNA顯著增加，而MIS組PPARγ表達減少，提示RSG能明顯增加PPARγ的表達，而MIS后則可減少PPARγ的產生；MIS+RSG組PPARγ表達高于MC組、RSG組及MIS組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。

a:P<0.05，b:P<0.01。

圖2 MIS及RSG治療對各組家兔血腫周圍腦組織PPARγ表達的影響

2.4 BBB通透性的變化 與MC組比較，RSG組及MIS組血腫周圍EB水平顯著降低，提示RSG治療及MIS均可降低BBB通透性。MIS+RSG組EB水平降低更為明顯，提示MIS后病灶區灌注RSG降低BBB通透性效果更加顯著，見表1、圖3。

a:P<0.05，b:P<0.01。

圖3 MIS及RSG治療對各組家免腦組織BBB通透性的影響

3 討 論

ICH是全球重大公共健康問題，占卒中類型的10%～15%，發病率及病死率均高，幸存者常常遺留神經功能殘疾，目前仍然沒有行之有效的治療方法[1-2]。近年來，MIS因其提高患者生存率，減少并發癥而成為除了開顱手術之外的另一種選擇[4]。雖然MIS能有效清除顱內血腫，解除血腫對腦組織的機械壓迫，但是不能清除滲入到血腫周圍腦組織的RBC及其裂解產生的細胞毒性物質，因而對繼發性腦損害的作用有限。越來越多的證據表明炎性反應是ICH后導致繼發性腦損傷的關鍵因素。RBC裂解釋放的血紅蛋白、亞鐵血紅素、亞鐵離子等細胞毒性物質需要及時清除以消除其細胞毒性作用[2]。因此，筆者推測MIS清除血腫后病灶區灌注能增強小膠質細胞/巨噬細胞吞噬功能的藥物是治療ICH的潛在靶點[6]。

研究證明MIS清除血腫后能減輕BBB通透性，但術后的繼發性腦損傷仍然很嚴重[5,11]。近期研究顯示了PPARγ在ICH中的作用。PPARγ是一種核激素受體，與其配體結合后通過抑制 NF-κB來降低炎性反應；還可啟動核內靶基因的轉錄來調節脂類和糖代謝及細胞的抗氧化機能[12]。小膠質細胞/巨噬細胞通過細胞表面清道夫受體CD36介導的RBC內吞作用是清除顱內血腫后滲入血腫周圍腦組織的RBC的主要途徑[2,13]。激活PPARγ可通過轉錄水平的調控上調CD36，從而幫助小膠質細胞/巨噬細胞通過吞噬或內吞作用來清除RBC[6-7]。

RSG臨床用于治療2型糖尿病，其作用機制是激活PPARγ受體，上調某些基因的表達從而增加外周組織對胰島素的敏感性，因此，RSG是高效的PPARγ激動劑[14]。在治療ICH方面，RSG通過上調PPARγ的表達，下調MMP-9水平[9]，減少BBB通透性，減輕腦水腫。

在MC組，血腫存在占位效應，RBC裂解產生的細胞毒性物質滲入血腫周圍腦組織，導致腦組織損傷，表現為嚴重的BBB通透性增加。血腫刺激腦組織產生更多的PPARγ預防或限制腦組織損害，因此，與MIS組比較，PPARγ顯著增加。

在MIS組，血腫占位效應被解除，細胞毒性物質如MMP-9減少，血腫周圍炎性反應過程被抑制，腦組織無需產生更多的PPARγ來減少ICH后炎性損害。因此，MIS組PPARγ水平與MC組比較顯著減少。

在MIS+RSG 組，PPARγ水平增加，EB水平顯著下降，表明MIS后病灶區灌注RSG能更有效地減輕繼發性腦損害。筆者先前發表的文獻表明MIS能減少MMP-9水平，減輕繼發性腦損傷[9]。Zhao等[7]報道PPARγ在促進血腫吸收和保護腦細胞免受血腫損害方面扮演了重要的角色。本研究中，MIS后病灶區灌注PPARγ激動劑RSG得到了肯定的結果。這種治療措施是否比目前臨床上治療ICH的方法對患者有益，是轉化醫學研究所面臨的課題。

綜上所述，MIS后病灶區灌注PPARγ激動劑RSG使PPARγ水平增加，BBB通透性減少，能有效減少繼發性腦組織損傷，改善神經功能。

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Effects of rosiglitazone infusion therapy following minimal invasive surgery for intracerebral hemorrhage evacuation on perihematomal secondary brain injury in rabbits*

RenSiying1，YangQin2，WuGuofeng1△，ZhangYan1，LiJun1

(1.DepartmentofEmergency,theAffiliateHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang，Guizhou550004，China；

intracerebral hemorrhage；rosiglitazone；peroxisome proliferator-activated receptor γ；hematoma,epidural,cranial；blood-brain barrier；secondary brain injury

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.28.003

國家自然科學基金資助項目(81460185/H09106)。 作者簡介：任思穎(1965-)，副主任醫師，碩士，主要從事腦血管疾病研究。△

R743.34

A

1671-8348(2016)28-3896-04

2016-06-13

2016-07-21)