固定化微綠球藻去除+4-N、34--P效果的研究

梁晶晶　蔣霞敏　江茂旺　張澤凌　韓慶喜

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

梁晶晶蔣霞敏江茂旺張澤凌韓慶喜

（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

為了探究固定化微綠球藻（Nannochloropsis oculata）去除污水中NH+4-N、PO34--P的效果，采用海藻酸鈉固定化包埋技術進行實驗。開展了固定化藻球大小、藻細胞包埋密度、藻球投放質量及充氣培養條件對NH+4-N、PO3--P去除效果的單因子試驗研究。結果表明，固定化藻球大小、藻細胞包埋密度、藻球投放質

微綠球藻；固定化；NH4+-N；PO34--P；去除率

微藻是一類原始且分布廣泛的營光合自養、異養或兼養的低等植物，一般要借助顯微鏡才能觀察到其細胞結構形態［1］； 其生長迅速，環境適應能力強，產量高效，含有許多陸地生物所缺乏的特殊生物活性物質，如EPA、DHA、蝦青素等［2—5］。微藻固定化技術始于20世紀80年代，在環境領域主要應用于廢水處理和生物監測，具有藻細胞密度高、反應速度快、固液分離效果好、運行穩定性高等［6，7］特點。固定化藻類處理廢水不僅反應速度快、去除效率高，還可以實現廢水資源的再生利用：一方面，經過處理的廢水可作為工農業用水而重新加以利用； 另一方面，處理后的固定化藻細胞易于收獲，進行加工生產，不僅避免產生二次污染，還可以加以綜合利用。影響固定化微藻生長和NH+4-N、PO34--P去除效率的因素可分外部因素和內部因素，內部因素主要是藻種本身生理特征的差異造成； 外部因素主要包括溫度、光照、營養條件、藻球規格大小、藻細胞包埋量、藻球用量等方面［8］。

微綠球藻（Nannochloropsis oculata）是一種較常見的單細胞海洋微藻，其細胞壁極薄且富含EPA，廣泛應用于蝦類、蟹類、貝類等的育苗及輪蟲、鹵蟲等培養。蔣霞敏［9］研究表明微綠球藻具有環境適應能力強，繁殖速度快，且不易老化污染的優點，能吸收水中氮磷等營養物質供給自身生長需要。關于固定化微綠球藻研究鮮有報道，僅見鄭蓮等［10］和黃翔鵠等［11］將固定化微綠球藻引入對蝦養殖水體，能有效降低水體中氨氮、亞硝酸氮等有害因子的濃度，同時能抑制弧菌的生長，提高水中溶解氧含量，使水體長時間保持較好的動態平衡狀態。本文以微綠球藻為藻種，采用海藻酸鈉包埋進行固定化，進行了不同藻球規格，藻細胞密度，藻球投放質量以及培養條件對固定化微綠球藻生長、NH+4-N和PO34--P凈化效果的試驗，為固定化微綠球藻應用于污水處理提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

試驗藻種微綠球藻來自寧波大學海洋學院餌料生物實驗室。培養液配方采用改良的寧波大學3#母液（表1），加入量母液與海水體積比為1 ：1 000。培養用水采用象山港天然海水，經沙濾、暗沉淀、脫脂棉過濾和燒開冷卻； 藻種置于GXZ智能型光照培養箱（寧波江南儀器廠）培養，培養條件：溫度（25±1）℃，鹽度25，光照強度80 μmol/（m2·s），pH 7.86，光暗周期12h ：12h，不充氣。為防止使用實際污水中的某些化學物干擾測定結果，本實驗采用了人工模擬污水，即在缺氮3#母液內加一定量的NH4Cl配制成人工污水備用（NH+4-N含量17 m g/L）。

藻球制作方法：將處于指數生長期的微綠球藻離心濃縮（4000 r/min，10min）兩次，取一定體積的藻細胞濃縮液與預先滅菌的5%海藻酸鈉溶液按照1 ：1均勻混合，形成海藻酸鈉和微藻的混合液； 用注射器吸取混合液，并套上20#針頭，在預冷的2% CaCl2溶液距離液面20 cm處，滴入混合液即形成直徑（3.5 mm）的小球，藻球在CaCl2溶液中靜置3h后取出，用消毒海水洗滌2—3次備用。

脫固定化方法：在測定固定化藻細胞密度時需先脫固定化，將固定化藻球放入盛有一定量3%的檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）化解液中，搖動，直至固定化藻球完全溶解成懸浮狀，再計數測定藻細胞密度。

表1　改良的寧波大學3#母液配方Tab. 1　Composition of modified 3# culture medium

1.2試驗方法

1.3檢測方法

相對增長率 K 值，計算公式為：K=（lg Nt-lg N0）/T，式中，N0為培養的起始濃度，Nt為培養 t 時間后的濃度，t為培養時間。

標準曲線方程為：y=5.8899x-0.0094，R2= 0.9992。

標準曲線方程為：y=2.7418x-0.0034，R2=0.999

氮磷的去除率R按下式計算：R=（C0-Ct）/Ct× 100%，式中：R表示去除率（%）； C0和Ct分別表示各種形態氮磷的初始濃度和各取樣時段濃度（mg/L）。

1.4數據統計與分析

數據、圖表用Excel進行處理，數據分析運用SPSS 17.0統計分析軟件進行相關分析，并采用Duncan多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2　結果

藻球直徑大小對藻細胞生長速率（K值）影響顯著（P＜0.05），隨著固定化藻球直徑增大K值呈先升高后降低趨勢，在藻球直徑3.5 mm時，K值最大（0.332±0.002），顯著高于（除藻球直徑3.0 mm外）其他各組（圖1）。

圖1　不同藻球直徑對微綠球藻生長的影響Fig. 1　Effects of different size of immobilized algal balls on the growth of Nannochloropsis oculata同行數據肩標無字母或相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）； 下圖同In the same rowzvalucs with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference（P＞0.05），while with different small letter superscripts mean significant difference（P＜0.05）； The same applies below

不同藻細胞包埋密度對K值影響顯著（P＜0.05），隨著藻細胞包埋密度增加，K值逐漸降低，在包埋密度100×104cells/ball時K值最大（0.330±0.033）（圖3）。

圖2　不同藻球直徑對微綠球藻NH+4-N，　34--P去除效果的影響Fig. 2　Effects of different size of immobilized algal balls on theN　H+4-N，　34--P removal efficiency by Nannochloropsis oculata圖例單位：mm　Legend unit：mm

圖3　不同藻細胞包埋密度對固定化微綠球藻生長的影響Fig. 3　Effects of different density of algal cells embedded on growth of immobilized Nannochloropsis oculata

水體中藻球不同投放量對藻細胞生長速率（K值）影響顯著（P＜0.05），隨著藻球用量的增加K值下降（圖5）。在藻球投放質量為10 g/L時K值達最大為（0.301±0.021）。

圖4　不同藻細胞包埋密度對固定化微綠球藻NH+4-N，34--P去除率的影響Fig. 4　Effects of different density of algal cells embedded on immobilized Nannochloropsis oculataNH+4-N，　34--P removal efficiency圖例單位為：×104cells/ball　Legend unit：×104cells/ball

+表2　不同藻細胞密度第1天和單位密度吸收NH+4-N效果對比Tab. 2　Contrast ofN　H4-N absorption of Nannochloropsis oculata in different densities at first day and unit density

+表2　不同藻細胞密度第1天和單位密度吸收NH+4-N效果對比Tab. 2　Contrast ofN　H4-N absorption of Nannochloropsis oculata in different densities at first day and unit density

初始密度Preliminary density（×104cells/ball）最終密度Final density（×104cells/ball）100　16.99±0.43c　0.169±0.004　 3.98±2.28d　0.039±0.023a　1110 300　 21.49±1.89ab　0.071±0.006　10.94±3.11c　0.036±0.010b　1137.5 500　 19.24±3.77bc　0.038±0.007　10.45±1.49c　0.021±0.003c　1762.5 700　 21.49±0.43ab　0.030±0.001　21.39±1.49b　 0.028±0.002cd　2025 900　25.24±1.15a　0.028±0.001　24.38±2.28a　0.027±0.002d　2037.5第1天去-N率Assimilation ratio at first day（%）NH+4單位密度去-N率Assimilation ratio at unit density（%/104cells）NH+4第1天去-P率Assimilation ratio at first day（%）3-4單位密度去-P率Assimilation ratio at unit density（%/104cells）3-4

圖5　不同投放質量對固定化微綠球藻生長的影響Fig. 5　Effects of different dosages of algae balls on immobilized Nannochloropsis oculata growth

圖6　不同投放質量對固定化微綠球藻NH+-N，　34--P去除率的影響4Fig. 6　Effects of different dosages of algae balls on immobilized Nannochloropsis OculataN　H+-N，　34--P removal efficiency4圖例單位：g/L　Legend unit：g/L

充氣培養對藻細胞生長速率（K值）影響顯著（P＜0.05），充氣培養條件下藻細胞K值為（0.306±0.006）；不充氣組K值為（0.177±0.010），顯著低于充氣組（圖7）。

圖7　充氣培養對固定化微綠球藻生長的影響Fig. 7　Effects of aerated cultures on immobilized Nannochloropsis Oculata growth

充氣培養對藻細胞氮磷去除率影響顯著影響顯著（P＜0.05）。第7天充氣組去除率為（85.93±0.45）%顯著高于不充氣組（49.32±0.45）%。充氣培養對藻細胞氮磷去除率影響顯著影響顯著（P＜0.05）。第7天充氣組去除率為（66.66±5.00）%顯著高于不充氣組（46.29±2.12）%（圖8）。

圖8　充氣培養對固定化微綠球藻NH+-N，　34--P去除率的4影響Fig. 8　Effects of aerated cultures on immobilized Nannochloropsis OculataN　H+-N，　34--P removal efficiency4

3　討論

固定化藻球的制作工藝對污水的處理密切相關，其中藻球直徑大小對藻細胞生長速率（K值）影響差異顯著（P＜0.05），本研究表明隨著固定化藻球直徑增大K值呈先升高后降低趨勢，在藻球直徑3.5 mm時K值最大（0.332±0.002）。隨著固定化藻球直徑增大，NH+4-N和PO34--P去除率以藻球直徑3.5 mm組效果最佳，這與袁冰等［12］的研究結果一致，在一定直徑范圍內藻球生長及NH+4-N和PO34--P去除率均是先升高后降低的趨勢； 這與楊海波等［13］的隨著藻球直徑越大藻球生長量越大結果不同，可能是藻球越小，制備過程交聯程度越大，藻球結構越致密，傳質性能受到影響； 隨著藻球直徑增大，藻細胞在藻球中分布不均勻，外部藻細胞對藻球內部有一定遮蔽作用，同時隨著藻球直徑增大，藻球通透性逐漸降低，藻球內細胞營養不足，生長環境較差等，對藻細胞的增值生長及氮磷等營養物質的吸收有一定阻礙作用。

水中投放固定化藻球的多寡直接影響污水處理效果，本實驗結果表明投放不同質量藻球對固定化藻生長及NH+4-N和PO34--P去除效果影響差異顯著（P＜0.05）。藻球投放量大，生長速率減小，NH+4-N和PO34--P去除速率卻增加。這與高鵬等［17］的觀點相吻合，固定化微藻投入量的增加，能一定效果提高NH+4-N和PO34--P去除速率，但是隨著固定化藻球用量達到一定值后，NH+4-N和PO34--P去除速率并不會相應提高，這種情況會造成藻球的浪費，在實際應用中，藻球與污水應有一個最佳比例值，這樣既能縮短污水凈化時間，又能節約成本。這是由于污水中隨著藻球投放量加大，有效藻細胞數目也多，參與反應的藻細胞數目多，對氮磷吸收的量大大增加，所以在短時間內去除NH+4-N和PO3--P的效果就

4好； 但藻球用量過多，不但藻球之間相互遮擋，對光照利用效率降低，光合作用降低，細胞生長速率也相應降低［16］； 而且藻球用量過大，制作藻球的成本就大大增加，處理污水就會得不喪失。

充氣與否對固定化藻去氮除磷密切相關，本實驗結果表明，充氣培養對固定化微綠球藻生長速率（K值）及氮磷去除速率影響差異顯著（P＜0.05）。在相同培養時間，充氣培養條件下固定化微綠球藻生長速率和氮磷去除率均高于不充氣條件。韓婷婷等［18］研究充氣培養能顯著提高半頁馬尾藻（Sargassum hemiphyllum）生長速率及活性磷吸收效果； 滕懷麗等［19］研究表明，充氣培養能顯著提高鹽藻（Dunaliella salina）的生長速率以及其對培養液中氮的吸收速率； 這與本實驗觀點一致，充氣培養能顯著提高藻的生長速率和氮磷去除效果。Svensen等［20］發現輕微的攪動促進浮游植物的生長，生長率高于完全靜止培養的浮游植物。海藻光合生長消耗水體中大量的無機鹽并釋放大量的氧，水體pH 升高，CO2等碳源供應不足引起藻體的最大光合作用能力下降［21，22］。充氣培養條件下促進空氣中CO2進入藻類培養水體［23］，向水體中及時補充藻體光合生長所需的無機碳源，調節水體pH，促進藻體光合固碳，從而加速藻體的生長［24］。同時，充氣加快藻體表面周圍的營養鹽交換，促進海藻同化吸收 N、P 營養鹽，為藻體光合作用和生長提供有利的條件。

4　結論

本實驗對固定化微綠球藻不同規格、不同藻細胞包埋密度、不同藻球投放質量和充氣培養進行了NH+4-N、PO34--P去除效果優化研究，得到最優條件為：固定化微綠球藻應進行充氣培養，藻球規格3.5 mm、藻細胞包埋密度100×104cells/ball、藻球投放量30 g/L。

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STUDY ON REMOVAL RATE OF NH4+-N AND PO43--P BY IMMOBILIZED NANNOCHLOROPSIS OCULATA

LIANG Jing-Jing，JIANG Xia-Min，JIANG Mao-Wang，ZHANG Ze-Ling and HAN Qing-Xi
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

Microalgae Nannochloropsis oculata，immobilized with sodium alginate，was used to explore its removal efficiency ofNH+4-N andPO34--P from artificial sewage water. Algae ball size，cell densities，dosages of algae balls，and aeration cultured were applied in the single-factor. The results showed that all these conditions significant impact the removal of ofNH+4-N andPO34--P. The growth rate of K value achieved the highest value（0.332±0.002） when the diameter was 3.5 mm； the removal rate ofNH+4-N andPO34--P were the highest one at the diameter was 3.5 mm，which were（75.08±3.83）% and（80.80±3.81）%，respectively. The maximum of the growth K values was（0.330±0.033） with the density of 100×104cells/ball. The highestNH+4-N andPO34--P removal rate were（87.20±0.43）% and（82.58±1.72）%，respectively，at the group of 300×104cells/ball； however，100×104cells/ball was the optimal algal cell density based on unit algal cells removal ratio ofNH+4-N andPO34--P. The increased algae balls dosages decreased the growth rate of K values. 10 g/L group had the maximum K values（0.301±0.02） and 50 g/L had the minimum K values（0.193±0.01）. The removal rates ofNH+4-N were（84.12±0.78）% and（84.63±0.45）% when the dosage was 30 g/L and 50 g/L，respectively. 30 g/L group had the highestPO34--P removal rate（77.13±1.43）%. Combined analyses revealed that 30 g/L was optimum for the dosages of algae balls. The K value，the removal ofNH+4-N andPO34--P were significantly（P＜0.05） higher with aeration than non-aerated； K values were（0.306±0.006） and（0.177±0.010），respectively；NH+4-N removal rates were（85.93±0.45）% and（49.32±0.45）%，respectively；PO34--P removal rates were（66.66±5.00）% and（46.29±2.12）%，respectively. This study optimized the conditions of immobilized microalgae Nannochloropsis oculata：immobilized Nannochloropsis oculata should be aerated cultures； algae ball size was 3.5 mm； the algal cell density was 100×104cells/ball； and the dosage of algae balls was 30 g/L.

Nannochloropsis oculata； Immobilization；NH+4-N；PO34--P； Removal rate

Q142

A

1000-3207（2016）05-1033-08

10.7541/2016.134

2016-01-11；

2016-04-10

國家海洋公益項目（201305022）； 浙江省公益項目（2015C3204）； 寧波市科技項目（2015C10062）寧波市創新團隊（2011B81003）資助 ［Supported by the Nonprofit Research Project for the State Oceanic Administration（201305022）； Nonprofit Research Project of Zhejiang Province（2015C3204）； Project of Science and Technology of Ningbo City（2015C10062）； the Innovative Group of Ningbo City（2011B81003）］

梁晶晶（1990—），女，河南開封人； 碩士； 主要研究方向為微藻生態學。E-mail：1245558982@qq.com

蔣霞敏（1957—），女，E-mail：jiangxiamin@nbu.edu.cn