顆石球緩解紫外輻射對顆石藻光合作用的脅迫

阮祚禧　鄒定輝　許振平　鄧　譽　王婷曄　黃鳳英　羅麗娜

（ 1. 汕頭大學科技中心海洋生物研究所，汕頭 515063； 2. 廈門大學海洋環境科學國家重點實驗室，廈門 361102； 3. 華南理工大學環境科學與能源學院，廣州 510006；4. 暨南大學生物科學技術學院生態系，廣州 510632）

顆石球緩解紫外輻射對顆石藻光合作用的脅迫

阮祚禧1，2鄒定輝3許振平1鄧譽1王婷曄1黃鳳英1羅麗娜4

（ 1. 汕頭大學科技中心海洋生物研究所，汕頭 515063； 2. 廈門大學海洋環境科學國家重點實驗室，廈門 361102； 3. 華南理工大學環境科學與能源學院，廣州 510006；4. 暨南大學生物科學技術學院生態系，廣州 510632）

顆石藻（Coccolithophore）是一類胞外具有數層鈣質顆石粒（Coccolith）的海洋鈣化金藻，在絕大部分海域均有分布。 顆石藻通過光合固碳向深海沉降有機碳顆粒，同時其鈣化作用形成的顆石粒是海底的重要沉積物。它們與鈣化浮游動物翼足類（Petropod）鈣化量可占海洋生物鈣化量的80%，對于海洋碳、鈣循環有重要意義［1，2］。

顆石藻在條件合適時，可形成大面積藻華（全球每年可達上百萬平方公里）［3］。促進藻華形成的環境因素很多［4—7］，其中較強的日照顯得尤為重要，因此，藻華時往往伴隨著較強的紫外輻射（UVR）。UVR可以透過水層數十米，到達藻華分布的位置（10-20m）［8］，這意味著藻細胞往往經受較高的UVR，并需要克服其對光合作用乃至生長產生的負面影響［9—12］。那么，顆石藻又是如何應對這一脅迫的？

顆石藻表面往往覆蓋一層又一層的顆石粒，形成殼狀結構的顆石球（Coccosphere）。這一特殊的結構具有何種生物學功能，一直吸引很多學者關注［13，14］。早在1952年，有學者提出其可能起到反射UVR的作用的猜想［15］。最近，我們的研究顯示：顆石球能夠消減陽光輻射中的部分UVR，并在酸化條件下，對于細胞鈣化以及顆石粒形成具有重要的影響［16］。然而，當前對于顆石粒的光學特性所知甚少，尤其是它如何影響光合作用電子傳遞，進而影響光合固碳。為此，本文以顆石藻的代表性種Emiliania huxleyi為材料，就顆石球光生物學功能展開研究。

1　材料與方法

1.1材料

赫氏顆石藻（Emiliania huxleyi CS369）購自澳大利亞聯邦科學與工業研究組織（CSIRO）微藻中心。顆石藻以K母液加富的過濾消毒海水為培養液［17］，在（18±1） ℃、光強為450 μmol/（m2·s）、光周期為14 ：10（光∶ 暗）的培養箱（GXZ型，中國）中進行適應培養8d。然后接入500 mL的三角瓶中（約2.0×105cell/mL），每天更換部分培養液，大約培養8d后進行相關參數的測量。

1.2細胞粒徑和顆石球厚度

細胞顆粒通過研究級顯微鏡（Zeiss Axioplan 2 Imaging，德國）觀察，并拍取10—15張圖像，用顯微圖像分析系統隨機測量100—150個細胞的直徑。其中，為獲取裸細胞的直徑，需用99.9%的CO2沖藻液去除顆石球。然后，顆石球的厚度可通過CO2酸化處理的裸細胞和帶顆石球的完整細胞之間的粒徑的差值獲得。

1.3細胞掃描光譜

首先用CO2去除胞外的顆石粒，再將這些裸細胞與帶顆石球的完整細胞按一定的比例混合，獲得不同平均厚度的顆石球。藻液直接過濾到Whatman GF/F玻璃纖維濾膜上，并以浸泡了新鮮培養液的GF/F濾膜為空白對照，利用雙通道分光光度計（Shimadzu UV2501PC，日本）獲取細胞的掃描光譜［16］。由裸細胞和完整細胞的透射光譜的差值獲得顆石球的吸收光譜，并計算紫外區和可見光區的平均吸光值。

由于數據是否能正確恢復是建立在收發兩端達到碼組同步、初始通道同步、幀/多幀同步的基礎上,故通過與第三方IP核的對接可以充分驗證本文設計接收同步系統的正確性。

1.4輻射處理

以太陽輻射模擬器（Realtime，德國）為光源，并利用不同的濾膜去除輻射中的多余波段：可見光（Photosynthetically Active Radiation，PAR），用Ultraphan UV Opak 395膜濾（Digefra，德國）除波長小于395 nm的輻射； 模擬全陽光輻射（PAR+UVR），用Ultraphan 295膜濾（Digefra，德國）除波長小于295 nm的輻射。其中PAR強度為91.3 W/m2［420 μmol/（m2·s）］、UVR強度為20.2 W/m2。

1.5快速光響應曲線

用脈沖調制熒光儀（Walz-WATER ED，德國）測定快速光響應曲線。快速光響應曲線的相對電子傳遞速率rETR計算公式［18］：

rETR=0.5×PAR×（F′m-F′s）/Fm

式中0.5表示吸收的光能在光系統Ⅰ和Ⅱ之間平均分配； F′m表示在光適應狀態下，當光系統Ⅱ的所有反應中心都處于關閉態且所有非光化學過程都處于最優狀態時的熒光產量； Fs表示穩態熒光產量，當外界條件保持恒定時，照射光化光后達到穩定值時的熒光產量。

1.6數據處理

2　結果

2.1顆石球的光學特性

顆石球對不同波段輻射的吸收與其平均厚度相關。就UVR的吸收率而言，顆石球厚度從0.1 μm（3.4%）增加到0.7 μm（10.5%），增加了2.1倍，但對PAR的吸收率增加更為明顯（從1.3%到5.5%），提高了3.1倍（圖1）。

圖1　顆石球對可見光（PAR）和紫外輻射（UVR）的消減Fig. 1　Reduction of transmission in photosynthetic active radiation（PAR） and ultraviolet radiation（UVR） by coccosphere of E. huxleyi

2.2顆石球的生長及其對光系統Ⅱ電子傳遞的影響

用CO2去除了顆石藻表面的顆石粒后，藻細胞經過4h生長直徑為5.1 μm時，顆石球平均厚度約為0.1 μm（圖2），細胞表面僅有少量的顆石粒出現，在顯微鏡中很難觀察到； 再過1.5h，顆石球厚度迅速增加到0.4 μm； 7h和9h，細胞的直徑為7.6和8.0 μm，基本或已形成完整的顆石球，厚度達到1.0和1.2 μm（圖2）。11h，顆石球厚度為1.0 μm，略有下降，但與前2h的厚度并沒有顯著差別（t-test，P=0.19）。在顆石球生長的過程中，裸細胞直徑并沒有顯著變化。

圖2　E. huxley去除顆石粒后，粒徑（A）和顆石球厚度（B）隨時間的變化Fig. 2　After coccoliths being removed，cell size（A） and thickness of coccosphere（B） varied with time -co，用CO2去除了顆石球的裸細胞；+co，帶有顆石球的完整細胞-co：cells treated with CO2； +co：untreated cells

顆石球厚度為0、1.0和1.2 μm的藻細胞（顆石粒被CO2去除后的1h、7h和9h）經過1h的輻射處理（PAR或PAR+UVR），它們的響應各不相同。僅接受PAR時，這些細胞的快速光響應曲線基本相互重合（圖3），rETRmax、Ek以及a之間沒有顯著差異（表1），顯示顆石球對光系統Ⅱ電子傳遞基本沒影響。接受PAR+UVR處理時，裸細胞的電子傳遞速率受UVR的抑制最為明顯，rETRmax僅為66±7，相對于PAR（156±3），電子傳遞速率下降了57.7%，大致是顆石球厚度為1.0和1.2 μm的顆石藻的下降幅度的3倍和6倍； 而最大量子產率a也有類似的情況，顆石球厚度為0、1.0和1.2 μm的藻細胞，分別被UVR抑制了60.5%、12.7%和8.8%，裸細胞的UVR抑制率是帶顆石球細胞的1.5—7倍，但飽和光強Ek似乎并不受UVR的影響。

3　討論

顆石粒具有特殊的光學特性［19］，使得顆石球能夠濾除部分PAR和有害UVR，尤其對于后者，其濾除的比率甚至是前者的5倍左右（圖1）； 并且隨著胞外顆石粒層數的增加，其消減的陽光輻射能力也增強。顆石球所消減的PAR似乎還不足以影響光系統Ⅱ的電子傳遞（圖3）和最終的光合固碳［16］，但其所消減的UVR，則能有效減少UVR對藻細胞光合作用所產生的脅迫。因此，顆石粒及其形成的顆石球除了具有調節浮力等功能外［13］，還具有透過可用于光合固碳的PAR而消減有害UVR的作用，改變微輻射環境的功能。

3.1顆石球的光學特性

Quintero-Torres等［19］的模擬研究表明，Calcidiscus leptoporus和Helicosphaera carteri的顆石?？娠@著地反向散射UVR，而對可見光（400—700 nm）的反向散射率則低得多，從而有利于這部分光進入細胞。雖然這兩種顆石粒的晶體類型與E. huxleyi的并不相同［20］，但特有的晶體構造方式，可能導致它們具有相似的光學特性。此外，顆石粒的大小也能直接影響其對光的散射。E. huxleyi的顆石粒的大小約為（1—2 μm），相對于＞2 μm的顆粒，該尺寸的方解石能更有效地散射海水中的光［21］，尤其是對波長＜500 nm的輻射更為明顯［22］。由此，細胞表面的顆石球較薄的時候，吸光區主要集中在波長小于500 nm的輻射，尤其是紫外區［16］。

隨著顆石粒層數增加，顆石球變厚，所消減的光譜也產生變化。厚度為0.7 μm的顆石球可消減11%UVR和5%PAR（圖1）； 當顆石球增加到1.2 μm，可消減大約20%—25%UVR和10%—15%PAR［16］。研究顯示，顆石球可顯著增強側向（90度）散射光［23］，可能是不同的顆石粒之間的相互疊加增強了顆石球的反射和散射。

3.2顆石球對顆石藻光合作用的影響

本文顆石藻的飽和光強在500 μmol/（m2·s）左右，與之前的相關報道大致相當［8，24］。顆石球被除去后，顆石藻的飽和光強雖然略微有點減少，但并不顯著，此外量子產率和最大相對電子傳遞速率也沒有受到影響（表1），顯示顆石球所消減PAR對E. huxleyi影響不大，可能與顆石藻本身耐受高光的生理特性有關［8，25］。

表1　相對電子傳遞速率參數Tab. 1　Relative electron transport parameters calculated from rapid light curve shown as Fig. 3

圖3　在可見光（PAR，A）和模擬全陽光輻射（PAR+UVR，B）條件下顆石球對E. huxleyi快速光響應曲線的影響Fig. 3　Effects of coccosphere on rapid light curve of E. huxleyi after one hour of exposure to photosynthetically active radiation（PAR，A）or photosynthetically active radiation plus ultraviolet radiation（PAR+UVR，B）

與PAR不同，顆石藻對UVR顯得非常敏感。E. huxleyi生長下降一半時，所接受UVR的劑量僅為其他浮游植物下降一半時的1/4，甚至更少［26］，少量增加UVR的劑量就能導致藻細胞的電子傳遞抑制顯著增強（表1）。如果按照1.2 μm顆石球消減約1/4的UVR計算［16］，去除顆石粒的裸細胞僅多接受約1.25 W/m2的UVR，但其最大電子傳遞速率抑制率就增加了接近5倍（表1）。原位實驗的結果顯示，浮游植物的光合固碳能力受UVB抑制的部分，往往與UVB強度而不是劑量有關［27］，因此顆石球通過反射或散射的方式降低細胞接收UVR的強度和劑量，對于顆石藻細胞抵御UVR，保護光系統起著重要的作用［11］。此外，UVR不僅能使光系統Ⅱ的反應中心蛋白降解失活［28］，還會間接抑制和減緩這一損傷的修復［29，30］，降低光系統Ⅱ反應中心的修復能力。因此，在UVR脅迫下，往往協同產生高光脅迫［25］。在這種情況下，顆石球所濾除的部分PAR（圖1），也可能在一定程度上有助于緩解光抑制。

3.3顆石球生長與晝夜光周期相適應

通常夜間，顆石藻進行細胞分裂，胞外顆石粒脫落，鈣化速率僅為光照條件下的十分之一，甚至更低［14］。當太陽剛剛升起的時候，新形成的顆石粒層較薄，有利于適應日出的早期階段：陽光輻射較弱，加上陽光進入海水的角度較小，水中的光強低于其光合作用的光補償點。顆石球的這一特性，有利于顆石藻能最大限度的利用光驅動電子傳遞和光合固碳。隨著日照增加，尤其到了8點前后，陽光輻射往往達到甚至超過了顆石藻的飽和光強［約400—500 μmol/（m2·s）左右］，鈣化作用也達到最大［24］。再經過2—4h的生長，在正午前后可形成完整的顆石球（圖2）。此時，海面的陽光輻射可達到1000—1500 μmol/（m2·s）（UVR 37—55 W/m2），甚至更高［8］，而顆石球的厚度也達到最大值（圖2），從而有助于消除部分的UVR和PAR，減少由此帶來的脅迫?？梢?，顆石球厚度變化的節律與陽光輻射的變化相適應，可消減高光和UVR對光合作用所帶來的負面影響，起到保護的作用。

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COCCOSPHERE RELIEVES THE STRESS OF ULTRAVIOLET RADIATION ON PHOTOSYNTHESIS IN THE COCCOLITHOPHORID EMILIANIA HUXLEYI

RUAN Zuo-Xi1，2，ZOU Ding-Hui3，XU Zheng-Ping1，DENG Yu1，WANG Ting-Ye1，HUANG Feng-Ying1and LUO Li-Na4
（1. Marine Biology Institute & Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology，Science Center，Shantou University，Shantou 515063，China； 2. State Key Laboratory of Marine Environmental Science，Xiamen University，Xiamen 361102，China；3. College of Environment and Energy，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；4. Institute of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Emiliania hulxeyi；顆石球；紫外輻射；相對電子傳遞速率

Emiliania hulxeyi； Coccosphere； Ultraviolet radiation（UVR）； Relative electron transport rates（rETR）

Q142.6

A

1000-3207（2016）05-1078-05

10.7541/2016.139

2015-10-12；

2016-01-25

汕頭大學青年基金（YR13002）； 近海海洋環境科學國家重點實驗室（廈門大學）訪問學者與開放課題（MELRS1305）； 廣東省大學生創新創業訓練計劃項目（201510560079）； 國家自然科學基金（31370476）； 廣東省海洋漁業科技與產業發展專項（A201401D03）； 廣東省科技計劃項目（2014A020217005）； 廣東省產學研項目（2012B091100341）資助 ［Supported by Foundation of Shantou University（YR13002）； Visiting Scholar Program of State Key Lab of Marine Environmental Science（Xiamen University）（MELRS1305）； University Student Innovation Improvement Project of Guangdong（201510560079），National Natural Science Foundation of China（31370476）； Fishery Science and Technology and Industry Development Project of Guangdong（A201401D03）； Science and Technology Program of Guangdong（2014A020217005）； Special Project on the Integration of Industry；Education and Research of Guangdong Province（2012B091100341）］

阮祚禧（1976—），男，福建省尤溪縣人；博士；主要從事藻類生理生態學研究。E-mail：run@stu.edu.cn