泥鰍精子和卵子結構及受精過程的細胞學觀察

2016-11-12 06:40:43高勝濤劉亞秋余仕祥王志堅

水生生物學報 2016年5期

胡　雨　高勝濤　劉亞秋　余仕祥　王志堅

（1. 西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，水產科學重慶市重點實驗室，重慶 400715； 2. 重慶市墊江縣農業委員會，重慶 408300）

胡雨1高勝濤1劉亞秋1余仕祥2王志堅1

研究旨在探討泥鰍精子受精時限及為其人工繁殖提供基礎資料。采用光鏡、電鏡技術對泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）精子、卵子和不同時間段的受精卵進行了觀察。結果顯示：泥鰍精子頭部無頂體，主要為核占據，核凹窩較淺，中段具不對稱的袖套，尾部軸絲為“9+2”結構，無側鰭。卵子動物極卵膜僅有一受精孔，受精孔為深凹陷、短孔道型。在20—21℃水溫條件下，授精后3s，精子開始穿過精孔管或已經進入卵子；授精后5—8s，形成精子星光；授精后70s，卵子處于第二次減數分裂后期；授精后6—8min，第二極體形成，等待排出；授精后20—25min，雌雄原核融合；授精后25—30min，受精卵進入第一次有絲分裂中期；授精后40—45min，第一次有絲分裂結束，二細胞形成。研究表明：成熟卵子精孔管內口徑（2.286±0.364） μm，而精子頭部直徑與其接近，單精受精；入水后150s內可受精。

泥鰍；精子；受精孔；受精過程

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）隸屬于鯉形目、鰍科、泥鰍屬，在我國除西部高原地區外，各河流干、支流以及水庫、湖泊、溝渠、稻田等水體均有分布［1］。其肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，具較好的藥用價值，被譽為“水中人參”［2，3］。目前，泥鰍已成為我國淡水養殖的重要種類，更是我國外貿出口的優質水產品［4］，經濟效益可觀。有關泥鰍的研究主要集中在生物學特性、人工繁殖、苗種培育、對環境適應性及種質資源現狀等方面［3，5—8］，而有關泥鰍受精生物學研究未見報道。本研究采用組織學、電鏡技術等方法研究了泥鰍精子的超微結構和受精的細胞學特點，探討泥鰍精子受精時限，以期豐富我國魚類受精生物學內容，并為人工繁殖提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1試驗材料

2014年4月由重慶市墊江水產站收集成熟雌雄泥鰍群體，運回室內暫養。光周期12 L ：12 D，記錄水溫。每天投餌3次。

1.2試驗方法

精子形態結構的觀察成熟精子涂片的制備需取新鮮精液用2.5%戊二醛固定2h，充分搖勻，涂片，甲醇固定，HE染色，Nikon DXM1200顯微鏡觀察、拍照。

精子超微結構觀察活體解剖取發育成熟的雄性泥鰍精巢，剪切成1 mm3左右小塊，用冷的2.5% 戊二醛固定，置4℃冰箱中保存。固定樣品經0.2 mol/L（pH7.4）磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，梯度乙醇脫水，丙酮置換，環氧樹脂650聚合包埋，LKB-5型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染，H-7500型透射電鏡下觀察并拍照，觀察成熟精子的超微結構。

人工授精及受精過程的觀察選擇發育良好的雌雄親魚人工催產，進行人工干法授精。受精卵的激活和胚胎孵化的水溫均為21—22℃，取成熟卵及人工授精后不同時間段的受精卵樣品分別用Smith氏液和2.5%戊二醛固定。保留部分受精卵于培養皿內進一步孵化，統計其受精率和孵化率分別為82.72%和76.24%。

經Smith氏液固定的受精卵，24 h后換至70%的乙醇中保存。脫水甲劑（無水乙醇∶氯仿∶冰醋酸= 6∶3∶1）、脫水乙劑（正丁醇∶氯仿∶冰醋酸= 6∶3∶1）依次脫水，松油醇透明，石蠟包埋，連續切片7—8 μm，HE染色，Nikon DXM1200顯微鏡觀察、拍照。

經冷的2.5%戊二醛固定的受精卵，置4℃冰箱中保存。固定樣品經0.2 mol/L（pH 7.4）磷酸緩沖液沖洗3次，置-80℃超低溫冰箱冷凍2h，冷凍干燥24h，標本定位，Jeoljec-3000FC噴鍍、JSM.6510LV掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3數據分析

采用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件測量各項指標，SPSS軟件對試驗數據進行分析，統計值以平均值±標準誤（mean±SE）表示。

2　結果

2.1精子的超微結構

泥鰍精子屬于鞭毛型，由頭部、中段和尾部三部分組成，全長（30.579±2.033） μm，尾長（26.936± 1.854） μm（圖版 Ⅰ-1）。

精子頭部多呈圓球形，少數呈梨形，直徑（1.877± 0.071） μm（圖版 Ⅰ-2、3），無頂體，被有質膜，質膜表面不平整，呈波浪形，細胞質相對較少。頭部主要結構是細胞核，細胞核圓形，核膜與質膜緊密相貼，核后端有一較淺的植入窩，植入窩偏向一側，其凹陷深度約為細胞核長徑的1/4，有的核內具有零星分散的核空泡，空泡中可見電子致密狀物質分布（圖版 Ⅰ-4），有的核內無核空泡（圖版 Ⅰ-5）。

中段較短，與細胞核后端相連，由中心粒復合體和袖套組成。中心粒復合體位于植入窩中，包括基體和近端中心粒?；w位于植入窩的下段，其后連著軸絲。近端中心粒的長軸與基體的長軸相互垂直，呈“T”字型排列。袖套接于細胞核的后端。在泥鰍精子的縱切面上，能見到不對稱的袖套，一側肥厚，另一側較薄，肥厚的一側含的線粒體和囊泡較多（圖版 Ⅰ-4）。

精子尾部即鞭毛。其起始于植入窩并由袖套腔向后延伸，主要結構為軸絲，軸絲屬典型的“9+2”型雙聯微管結構（圖版 Ⅰ-6），軸絲外由細胞質膜包裹，軸絲前段波浪形起伏的質膜內具少量細胞質，無側鰭（圖版 Ⅰ-7）。

2.2成熟卵的結構

剛產出的泥鰍成熟卵金黃色半透明，圓球形，平均直徑約0.90 mm。受精卵具弱黏性，在水溫21—22℃時，授精后40—45min多數卵分裂為二細胞。成熟的未受精卵遇水也會膨脹，并能夠進行卵裂至囊胚期，但不能完成后續的胚胎發育。

卵子外層為卵膜，屬初級卵膜。卵膜內側為卵子質膜，質膜表面具微絨毛。卵膜厚約（5.994± 0.511） μm，光鏡下呈豎條紋狀，HE染色可觀察到兩層亞結構，靠近卵黃層厚（4.817±0.617） μm，染色淡藍紫色為其內層；外側厚（1.430±0.206） μm，染色深紅色為外層。

掃描電鏡下可觀察到卵子動物極具一個凹陷區，即漩渦狀的受精孔，呈順時針方向。受精孔由前庭和精孔管組成，前庭底部為精孔管外口，精孔管外口周邊呈平滑的圓環狀結構，外口徑（3.639±0.587） μm（圖版 Ⅱ-1）。卵膜在受精孔前庭形成部位逐漸加厚，最厚處為（8.240±0.803） μm，隨后逐漸變薄，由拐點處開始至受精孔底部為受精孔的凹陷區。泥鰍的受精孔為深凹陷，短孔道型。前庭是受精孔的主體，呈漏斗狀，最大直徑（39.245±3.845） μm，深（15.038±1.347） μm。精孔管貫穿前庭底部和胞質，長（2.694±0.573） μm，內口徑（2.286±0.364） μm（圖版 Ⅱ-2）。

成熟卵子處于第二次減數分裂中期，其分裂相在細胞質淺層，位于精孔管側下方凹陷質膜處，凹陷的質膜無微絨毛。紡錘體長軸（10.518± 0.939） μm，短軸（8.532±0.66） 8 μm（圖版 Ⅱ-3）。此時質膜下有許多皮層小泡，離精孔管越近，皮層小泡越少，在精孔管凹陷的正下方皮層小泡完全消失。卵黃位于卵子中央，多呈圓形或不規則形，由膜包被，顆粒大小不等（圖版 Ⅱ-4）。

2.3受精過程的觀察

授精0s，卵子周圍黏附大量精子，可觀察到部分卵子前庭區出現第一極體，呈球狀，直徑約7.433—31.972 μm（圖版 Ⅲ-1），有的第一極體表面具小突起。有受精孔附近出現一大一小兩個球體。精孔管打開，部分成熟卵子精孔管側下方凹陷的質膜外側連有第一極體，多數為橢圓形［（11.437± 1.128）×（7.916±1.190） μm］（圖版 Ⅲ-2），少數為球形。核近圓形，HE染色呈藍色。

授精后3s，大量精子聚集到受精孔，精孔管呈現不同狀態，有的精子剛進入其中（圖版 Ⅲ-3），有的精孔管敞開著（圖版 Ⅲ-4），有的精孔管口出現第一極體（圖版 Ⅲ-5），也有的精子已入卵且精孔管口被無定形絮狀物堵塞（圖版 Ⅲ-6）。

授精后5—8s，多數精孔管口被絮狀物堵塞或者精孔管外口縮小（圖版 Ⅲ-7、8），少數仍敞開著。觀察到有精子穿過精孔管進入皮層約7.664 μm。進入卵子皮層的精子，頭部開始膨大，釋放中心粒，產生微弱精子星光（圖版 Ⅲ-9）。動物極最外層部分皮層小泡破裂，釋放內含物。

授精后10—20s，由于絮狀物逐漸堵住精孔管口，遲到的精子不能進入其中被堵在外（圖版 Ⅲ-10），有的精孔管仍敞開著。進入皮層的精子星光開始延長。卵膜開始膨脹且部分卵膜和質膜之間形成卵周隙（圖版 Ⅲ-11），前庭處出現受精錐（圖版Ⅲ-12）。

授精后25—30s，掃描電鏡下，精孔管幾乎完全堵塞（圖版 Ⅲ-13）。皮層中的精子發出放射狀的精子星光（圖版 Ⅲ-14）。受精錐變大。

授精后35—50s，精孔管完全堵塞，有的受精孔被許多解體的精子堵?。▓D版 Ⅲ-15）。精子星光擴張，頭部繼續膨脹，逐漸位于精子星光的中央（圖版Ⅲ-16）。皮層反應明顯，卵膜與質膜之間形成較明顯的卵周隙。深層的皮層小泡移到皮層淺層。皮層小泡內含的球狀內含物以完整的形式釋放出來（圖版 Ⅲ-17）。此時仍可觀察到第一極體，位于卵膜與精孔管側下方凹陷質膜之間，但未與質膜相連（圖版 Ⅲ-18）。

授精后55—70s，掃描電鏡下，受精錐向外突出，有的甚至突出前庭外，其表面具許多小孔（圖版 Ⅲ-19）。授精70s，卵子的染色體已經準備向兩極移動。

授精后80—110s，受精錐逐漸解體，前庭內凝在一起的精子形態模糊，受精孔附近卵周隙逐漸擴大。可觀察到第一極體出現在前庭區的卵膜外，呈球狀，直徑（7.206±0.859） μm（圖版 Ⅲ-20）。

授精后120s，少數卵子未受精，精孔管口仍敞開著。少量皮層小泡在釋放內含物，卵周隙內充滿解體的皮層小泡內含物，受精孔附近的質膜平整。

授精后150s，掃描電鏡下，所有卵子精孔管關閉。卵子處于第二次減數分裂后期。

授精后4min，卵子染色體繼續向兩極移動（圖版 Ⅲ-21）。細胞質向動物極流動，胚盤區開始加厚。

授精后6min，進入第二次減數分裂末期，第二極體略突出于質膜表面。觀察到還有極少數第一極體未排出卵膜外。

授精后8min，卵子進入第二次減數分裂后期，此時紡錘體長徑（14.230±0.575） μm，一端突出于卵子質膜表面，染色質已經被拉向兩極，即將形成第二極體排出（圖版 Ⅲ-22）。動物極皮層區明顯厚于其他區域。

授精后10min，精子星光四射，精核解除濃縮狀態、膨大形成雄原核，雄原核先于雌原核到達胚盤中央，等待與雌原核結合。

授精后20—25min，雌雄原核已經靠近，開始融合，核膜解體，成為合子。

授精后25—30min，受精卵處于第一次有絲分裂中期（圖版 Ⅲ-23），染色體排列在紡錘體中間，動物極頂部開始凹陷。

授精后40—45min，受精卵完成第一次有絲分裂，分裂溝形成，胚盤分裂成兩個細胞，細胞基部與卵黃物質相連（圖版 Ⅲ-24）。

3　討論

3.1泥鰍與其他硬骨魚類精子超微結構的異同點

泥鰍屬于體外受精的魚類，精子頭部主要結構是細胞核，無頂體，尾部軸絲為“9+2”雙聯微管結構，這些特征與大多數硬骨魚類是相同的。

大多數魚類精子頭部為圓球形，而泥鰍還具有梨形的頭部。精子細胞核內的核泡可能在受精過程中起到緩沖保護的作用［9］，可分為兩種，一種為透明狀，內無電子致密物質，另一種為周邊空白，中間含有少量電子致密物質［10］。泥鰍精子縱切面上，觀察到有的核內含1至多個大小不等的核泡。核泡分布無規律性、周邊空白，中間還有少量電子致密物質，屬于上述核泡的第二種類型。而有的核內無核泡，可能是成熟精子染色質濃縮過程中細胞核的體積和表面積大大縮小，導致核泡消失［11］。

不同物種精子植入窩深度不同，鯉科魚精子的植入窩一般較淺［12，13］。泥鰍精子細胞核后端的植入窩凹入深度約為細胞核的1/4，袖套呈不對稱形式，這與同為隸屬于花鰍亞科的大鱗副泥鰍相同［14］。而鲇形目中的鲿科如長吻鮠［15］、黃顙魚［16］和鱸形目中的鯛科如真鯛、平鯛［17］等的核凹陷較深。也有些魚類如褐籃子魚無植入窩［18］。目前，植入窩的深度已被作為魚類分類依據的佐證之一［19］。

3.2受精方式及單精受精

受精孔是硬骨魚類精子入卵的唯一通道，其形態結構因物種不同而有所差異。硬骨魚類的受精孔通常只有一個，鱘類除外，如白鱘［20］、中華鱘［21］等具多個受精孔。鱘類的受精方式為多精入卵、單精受精，入卵的精子最終只有一個雄原核與雌原核結合形成合子，其余雄原核作為營養物質被卵子吸收。而泥鰍與大多數魚類一樣，只有一個受精孔，受精孔屬于深凹陷、短孔道型。受精前精孔管敞開，精孔管內口徑（2.286±0.364） μm，而泥鰍的精子頭部直徑（1.877±0.071） μm。精孔管內口徑與精子頭寬相近，只能允許一個精子進入細胞質，這與赤眼鱒、歐洲鯰相同［22，23］。泥鰍的受精方式為單精入卵、單精受精，且主要通過三種方式阻止多精入卵：（1）精孔管的內口徑只允許一個精子進入；（2）當第一個精子進入卵子細胞質后，精孔管立即被絮狀物堵塞或者精孔管外口縮??；（3）皮層反應釋放皮層小泡內含物于卵周隙中使得卵膜外舉硬化形成受精膜，阻止多余精子入卵。

泥鰍的受精程序也與其他硬骨魚類基本相同，即精子入卵、卵子激動、產生星光、形成雌雄原核到形成合子核，最終完成第一次卵裂。

3.3關于第一極體

傅朝君等［24］報道草魚V期成熟的卵子處于第二次減數分裂中期，等待與精子結合受精，紡錘體附近的卵膜下可看到被排出的第一極體。在泥鰍成熟卵子授精后0—6min內可觀察到位于卵膜下，與凹陷質膜外側相連的第一極體，有的第一極體未與凹陷質膜相連，位于卵膜與質膜之間，還可觀察到有的第一極體在前庭外，位于受精孔附近，與卵膜相連，表面具小突起，其直徑是未排出第一極體的1—4倍。由于在受精孔附近觀察到了一大一小兩個球體的現象，因此推測第一極體排出后，仍可以分裂為兩個極體。但泥鰍卵子授精6min也可觀察到極少數未排出卵膜的第一極體，由于第二極體是在授精8min時等待排出，因此推測第一極體的存在可能不會影響到第二極體的排出。

3.4精子入卵時間與精子活力

魚類種類不同，精子入卵時間不同。尼羅羅非魚授精后50s，精子開始入卵［25］。魴授精后2s開始進入精孔管［26］，胭脂魚授精后3s開始有精子入卵［27］。泥鰍人工授精后3s，大量精子聚集到卵子的精孔器，甚至已有精子進入精孔管。這與沈其璋等［28］在6—7月對泥鰍進行人工授精，發現授精2s有精子的尾部留在精孔管外相符。推測極短時間內泥鰍精子入卵的原因可能有兩個：（1）與胭脂魚、唇、稀有鮈鯽相比［27，29，30］，泥鰍卵子前庭深度較淺，精子需移動的距離較短。（2）泥鰍精孔器呈漩渦狀，有利于精子的云集卷入精孔管［28］。

泥鰍精子入卵后立刻有絮狀物堵住精孔管，這與大鱗副泥鰍不同，后者授精后5s精子入卵，2—3min后絕大部分卵子的受精孔才完全封閉［31］。然而，泥鰍授精后120s，仍有少數卵子未受精，精孔管口仍敞開著，這可能是人工授精后，最先到達受精孔的精子遇到部分成熟卵子前庭處正排出第一極體，則在受精孔附近不停擺動鞭毛，等待第一極體排出后進入精孔管。這需要其精子的運動時間較長。水溫19℃時，泥鰍精子強烈運動時間為58—130s，壽命時間為245—303s［32］，而本研究人工授精的水溫為21—22℃，該溫度可能延長了精子強烈運動的時間，因此授精120s后，泥鰍精子仍具有強烈運動的能力，可以繼續完成進入精孔管的過程。張濤等［33］認為日本鰻鱺授精后90s所有的復合體孔均封閉，其卵在入海水90s前都能受精，說明魚類卵子在所有復合體孔封閉前都能受精。本研究中觀察到泥鰍授精150s時，所有卵子精孔管關閉，推測其卵在入水后150s內都能受精，其精子的活力可能至少可以維持到150s。

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CYTOLOGICAL STUDIES ON STRUCTURE OF SPERMS AND EGGS OF MISGURNUS ANGUILLICAUDATUS AND THE FERTILIZATION PROCESS

HU Yu1，GAO Sheng-Tao1，LIU Ya-Qiu1，YU Shi-Xiang2and WANG Zhi-Jian1
（1. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development，Ministry of Education，Chongqing Key Laboratory of Aquatic Science，School of Life Science，Southwest University，Chongqing 400715，China； 2. Agriculture Committee of Dianjiang，Chongqing 408300，China）

This study investigated fertilization of spermatozoa of Misgurnus. anguillicaudatus at different time periods using optical microscope and electron microscope technology methods. The results showed that no acrosome was observed in the head of the sperm，which was mainly occupied by the nuclear. The implantation fossa of the sperms was low，and the mid-piece contained asymmetric sleeve. The flagella without lateral fins were organized as a “9+2” microtubular structure by axonemes. There was only one micropyle in shell of egg's animal pole，and the micropyle belongs to the type of concave and short channel. Under the water temperature of 20—21，sperm passed micropylar tube and entered ovum at 3s after insemination； sperm star light was observed at 5—8s； the second meiosis of the ovum occurred at 70s after insemination； the second polocyte appeared at 6—8min after insemination. Male and female prnucleus were fused at 20—25min after insemination. Zygote was in metaphase of first mitosis at 25—30min after insemination. The first mitosis finished at 40—45min after insemination，and two cells then formed. The inner diameter of micropylar tube of mature egg was（2.286±0.364） μm，similar like the diameter of sperm head，and the monospermy of M. anguillicaudatus. Eggs of M. anguillicaudatus were fertilizable in 150s after entering to water.

Misgurnus anguillicaudatus； Sperm； Micropyle； Fertilization process