額爾齊斯河白斑狗魚(yú)假尾復(fù)口吸蟲(chóng)的分子鑒定

番林古麗·熱哈提　焦　麗　岳　城

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

額爾齊斯河白斑狗魚(yú)假尾復(fù)口吸蟲(chóng)的分子鑒定

番林古麗·熱哈提焦麗岳城

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

利用分子生物學(xué)方法對(duì)采自額爾齊斯河（中國(guó)段）的白斑狗魚(yú)（Esox lucius Linnaeus）晶狀體內(nèi)寄生的復(fù)口吸蟲(chóng)（Diplostomum）進(jìn)行了種類(lèi)鑒定，結(jié)果顯示其種類(lèi)為假尾復(fù)口吸蟲(chóng)（D. paracaudum），為中國(guó)新記錄種。通過(guò)PCR擴(kuò)增待鑒定種的部分18S-ITS1-5.8S序列，測(cè)序后與GenBank中假尾復(fù)口吸蟲(chóng)的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其相似度達(dá)到99.6%。將該序列與7種復(fù)口吸蟲(chóng)的ITS1序列進(jìn)行比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)以單殖吸蟲(chóng)Gyrodactylus parvae為外類(lèi)群，結(jié)果顯示：待鑒定種與假尾復(fù)口吸蟲(chóng)（D. paracaudum）聚為一支，其支持率達(dá)到了50%以上，支持它們?yōu)橥幌x(chóng)種。

額爾齊斯河；白斑狗魚(yú)；假尾復(fù)口吸蟲(chóng)；分子鑒定

額爾齊斯河（Irtysh River）發(fā)源于中蒙邊境，地處歐亞大陸腹地，上游在我國(guó)境內(nèi)，位于新疆阿爾泰地區(qū)東北部，該河以東西走向流出國(guó)境，進(jìn)入齋桑泊（布赫塔爾馬水庫(kù)），匯入鄂畢河，最終流入北冰洋，是新疆重要的生態(tài)屏障和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展支撐之一［1，2］。額爾齊斯河水資源豐富，水系繁雜極具特殊性，使該河有了較多獨(dú)特的魚(yú)類(lèi)，主要有白斑狗魚(yú)（Esox lucius）、哲羅鮭（Hucho taimen）、細(xì)鱗魚(yú)（Brachymystax lenok）、高體雅羅魚(yú)（Leuciscus idus）等名貴獨(dú)特的魚(yú)類(lèi)。白斑狗魚(yú)隸屬于鮭形目（Salmoniformes）、狗魚(yú)科（Esocidae），狗魚(yú)屬（Esox），具有肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，自然分布見(jiàn)于亞洲、歐洲及北美洲北部的冷水水域，在我國(guó)僅分布于新疆額爾齊斯河水系，是一種較大型的名貴經(jīng)濟(jì)型魚(yú)類(lèi)［3，4］。郝翠蘭等［5］對(duì)額爾齊斯河（中國(guó)段）白斑狗魚(yú)的寄生蟲(chóng)種類(lèi)及感染情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示白斑狗魚(yú)被5種寄生蟲(chóng)感染，分別為復(fù)口吸蟲(chóng)后囊蚴、單腸四鉤蟲(chóng)、絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)、新疆鳋、白鮭鲺，其中復(fù)口吸蟲(chóng)是白斑狗魚(yú)寄生蟲(chóng)群落的優(yōu)勢(shì)種。

復(fù)口吸蟲(chóng)（Diplostomum）的囊蚴階段寄生在魚(yú)類(lèi)的眼球中，導(dǎo)致晶體混濁成乳白色，故又稱(chēng)“白內(nèi)障病”，嚴(yán)重感染時(shí)可致宿主失明，由于運(yùn)動(dòng)和索餌障礙，易被終末宿主鳥(niǎo)類(lèi)捕捉，也可直接引起魚(yú)類(lèi)大量死亡，特別是池塘養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)［6］。復(fù)口吸蟲(chóng)病在世界上有著廣泛的分布。最早的研究是在19世紀(jì)初葉，Nordmann（1832）在幾種淡水魚(yú)的眼球和皮膚內(nèi)發(fā)現(xiàn)了復(fù)口吸蟲(chóng)的囊蚴，并定名為Diplostomum volen。Braun（1894）用Nordmann發(fā)現(xiàn)的后囊蚴，進(jìn)行人工感染紅嘴鷗（Larusridibundus）獲得了成蟲(chóng)，并定名為匙形復(fù)口吸蟲(chóng)（Diplostomum spathaceum）。Diesing（1850）從鳥(niǎo)類(lèi)中獲得的此類(lèi)型的成蟲(chóng)，定名為Diplostomum grande。此后，有不少?lài)?guó)家的學(xué)者陸續(xù)在一些鷗鳥(niǎo)和魚(yú)類(lèi)中，發(fā)現(xiàn)了超過(guò)41種復(fù)口吸蟲(chóng)的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)，并對(duì)它們的形態(tài)、生活史和分類(lèi)學(xué)等諸方面做了大量的研究［7—9］。目前，我國(guó)僅描述了3種即倪氏復(fù)口吸蟲(chóng)（D. niedashui）、湖北復(fù)口吸蟲(chóng)（D. hupehensis） 和山西復(fù)口吸蟲(chóng)（D. shanxinensis）［10，11］。2009年4月至2014年7月我們對(duì)額爾齊斯河白斑狗魚(yú)（Esox lucius）進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)其晶狀體內(nèi)寄生1種復(fù)口吸蟲(chóng)囊蚴，通過(guò)提取不同蟲(chóng)體基因組，針對(duì)18S-ITS1-5.8S rDNA 序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。研究結(jié)果顯示：該復(fù)口吸蟲(chóng)隸屬于吸蟲(chóng)綱（Trematoda）復(fù)殖吸蟲(chóng)亞綱（Digenea）鶚形目（Strigeiformes）雙穴科（Diplostomidae）復(fù)口吸蟲(chóng)屬（Diplostomum） 的假尾復(fù)口吸蟲(chóng)（Diplostomum paracaudum）。

1　材料與方法

1.1材料來(lái)源

2009年4月至2014年7月，從額爾齊斯河流域的北屯、福海、布爾津、哈巴河、185 團(tuán)等采樣點(diǎn)捕獲或采購(gòu)白斑狗魚(yú)樣本，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行編號(hào)記錄后，測(cè)量體長(zhǎng)并進(jìn)行解剖檢查，采集晶狀體內(nèi)的復(fù)口吸蟲(chóng)，分別固定于95%的乙醇溶液中。

1.2目的基因的提取及PCR擴(kuò)增

取酒精固定的蟲(chóng)體樣本置于TE緩沖液（pH 8.0）中浸泡過(guò)夜，吸去TE緩沖液，用Omega軟體動(dòng)物DNA小量提取試劑盒提取蟲(chóng)體DNA，并在-20℃保存。

由上海生工合成的，以18S-ITS1-5.8S序列為擴(kuò)增引物。上游引物：18S-ITS1（5′-CCGTCGCTACT ACCGATTGAA-3′），下游引物：ITS1-5.8S（5′-CGCAATGTGCGTTCAAGATGTC-3′）［12］。PCR反映體系為50 μL，各物質(zhì)及其體積如下：10×Taq MasterMix 25 μL，上游引物（10 mmol/L） 1 μL，下游引物（10 mmol/L） 1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水21 μL。反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后為94℃預(yù)變性10min； 94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10min，4℃∞。

1.3目的DNA序列的測(cè)定

將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，得到目的條帶切膠后用OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接到 pEASY-T1載體進(jìn)行TA克隆，經(jīng)DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，用Transgen公司的EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取質(zhì)粒DNA，選取陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工測(cè)序。

1.4分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

從GenBank下載具有18S-ITS1-5.8S核酸序列的復(fù)口吸蟲(chóng)屬（Diplostomum）7種，總計(jì)13個(gè)樣本及一外類(lèi)群Gyrodactylus parvae，其核酸序列見(jiàn)表1。利用計(jì)算機(jī)MEGA5.1軟件構(gòu)建鄰接法（Neighborjoining）、最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1　來(lái)自GenBank的復(fù)口吸蟲(chóng)18S-ITS1-5.8S基因序列Tab. 1　18S-ITS1-5.8S sequences of Diplostomum from GenBank

2　結(jié)果

2.1基于18S-ITS1-5.8S rDNA基因的遺傳距離分析

利用計(jì)算機(jī)MEGA5.1軟件建立基于18S-ITS1-5.8S基因序列的7種復(fù)口吸蟲(chóng)（13個(gè)樣本）與本實(shí)驗(yàn)待測(cè)種B1的遺傳矩陣見(jiàn)表2。矩陣顯示B1與D. paracaudum Dip01的遺傳距離較短，為0.003。

2.2基于18S-ITS1-5.8S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于所得到的數(shù)據(jù)，以G. parvae為外類(lèi)群進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。利用計(jì)算機(jī)MEGA5.1軟件構(gòu)建鄰接法（Neighbor-joining）（圖1）分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)，樹(shù)上各分支上的數(shù)字用1000次Bootstrap來(lái)檢測(cè)分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的置信度。待鑒定種B1與D. paracaudum Dip01聚為一支，其Bootstrap支持率為58%。

應(yīng)用最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(shù)（MP樹(shù)，圖2）。MP樹(shù)與NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示結(jié)果一致：待鑒定蟲(chóng)種B1與D. paracaudum Dip01在進(jìn)化樹(shù)中均聚為一支。

表2　18S-ITS1-5.8S rDNA序列區(qū)域的遺傳距離Tab. 2　The distance of 18S-ITS1-5.8S rDNA genetic region

圖1　基于18S-ITS1-5.8S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ樹(shù)）Fig. 1　Phylogenetic analysis of 18S-ITS1-5.8S gene（NJ tree）

圖2　基于18S-ITS1-5.8S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（MP樹(shù)）Fig. 2　Phylogenetic analysis of18S-ITS1-5.8S gene（MP tree）

3　討論

復(fù)口吸蟲(chóng)的種類(lèi)在世界各地都有，主要原因是其宿主范圍廣，可隨著終末宿主鳥(niǎo)類(lèi)的遷移，使蟲(chóng)卵得到廣泛散布。此外，第二中間宿主魚(yú)類(lèi)的洄游也可帶來(lái)復(fù)口吸蟲(chóng)在地理區(qū)域上的擴(kuò)散和流行［13，14］。早期對(duì)復(fù)口吸蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定主要是通過(guò)囊蚴的焰細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量和排列方式進(jìn)行的，但不同種類(lèi)的復(fù)口吸蟲(chóng)囊蚴階段的形態(tài)特征非常相似，所以觀察十分困難，而且受采樣時(shí)間及不同研究者的認(rèn)知水平等限制，極易導(dǎo)致人為的差異。因此，僅靠其形態(tài)特點(diǎn)鑒定是不足的。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，為我們提供了除利用形態(tài)學(xué)以外的另一種寄生蟲(chóng)鑒定方法。DNA序列分析可用于鑒定所有發(fā)育階段的蟲(chóng)體，這是研究對(duì)具有復(fù)雜生活史寄生蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)手段［15］。特別是對(duì)像復(fù)口吸蟲(chóng)這樣難以獲得成蟲(chóng)的物種，這樣的技術(shù)更有意義。選取容易采集，而且具有不同形態(tài)的復(fù)口吸蟲(chóng)囊蚴，通過(guò)分析比較其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的差異，可以用來(lái)檢測(cè)未定種。

本研究選取ITS基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)額爾齊斯河魚(yú)類(lèi)復(fù)口吸蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，經(jīng)鑒定分析發(fā)現(xiàn)該吸蟲(chóng)為D. paracaudum。D. paracaudum的尾蚴和囊蚴在波蘭、德國(guó)、芬蘭和英國(guó)，成蟲(chóng)在芬蘭的小黑背鷗（Larvsfuscus）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，并獲得了尾蚴、囊蚴、成蟲(chóng)的部分ITS1序列及尾蚴的部分COⅠ序列，完成了整個(gè)生活史的分子鑒定工作［16，17］。在中國(guó)大陸，尚未發(fā)現(xiàn)D. paracaudum方面的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)是對(duì)中國(guó)境內(nèi)D. paracaudum的首次報(bào)道。目前D. paracaudum已確定的分布地有波蘭、德國(guó)、芬蘭和英國(guó)，從地理分布上可以看出此種復(fù)口吸蟲(chóng)多分布于歐洲。在額爾齊斯河發(fā)現(xiàn)該種復(fù)口吸蟲(chóng)，證實(shí)了額爾齊斯河這一橫跨歐亞大陸的河流特性，即其寄生蟲(chóng)區(qū)系與歐洲相近，而不同于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的寄生蟲(chóng)區(qū)系。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于復(fù)口吸蟲(chóng)的研究主要還是集中在第二中間宿主魚(yú)類(lèi)感染的囊蚴方面，包括感染率、感染強(qiáng)度、感染豐度、魚(yú)類(lèi)宿主的種類(lèi)等流行病學(xué)層面上，但對(duì)這些蟲(chóng)體的分類(lèi)學(xué)方面的研究較少。本次發(fā)現(xiàn)的復(fù)口吸蟲(chóng)為中國(guó)新記錄-D. paracaudum，鑒于額爾齊斯河獨(dú)特的地理位置，對(duì)該地區(qū)的寄生蟲(chóng)分類(lèi)鑒定方面的研究對(duì)我國(guó)寄生蟲(chóng)區(qū)系研究意義重大，本文發(fā)現(xiàn)的新記錄種為我國(guó)不同地域魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)的區(qū)系組成、病原分布、種群生態(tài)等方面提供科學(xué)資料。

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MOLECULAR IDENTIFICATION OF DIPLOSTOMUM PARACAUDUM ON ESOX LUCIUS IN IRTYSH RIVER

Parengul · Rahat，JIAO Li and YUE Cheng
（College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

The current study identified a species of Diplostomum from the lens of Esox lucius in Irtysh River（China section） using molecular biology techniques. These results showed that this species was Diplostomum paracaudum，a new record of this kind of species in China. The similarity of partial 18S-ITS1-5.8S sequence between this sample and another D. paracaudum from GenBank was 99.6%. A phylogenetic tree analysis based on the partial 18S-ITS1-5.8S of 7 species in the genus of Diplostomum identified an out group species Gyrodactylus parvae，and supported our sample was closely related to D. paracaudum with a more than 50% bootstrap.

Irtysh River； Esox lucius Linnaeus； Diplostomum paracaudum； Molecular identification

Q959.15

A

1000-3207（2016）05-0992-05

10.7541/2016.128

2016-02-19；

2016-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360644）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 31360644）］作者簡(jiǎn)介：番林古麗·熱哈提（1989—），女，哈薩克族，新疆阿勒泰人； 碩士研究生； 研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：1002497734@qq.com通信作者：岳城（1958—），男，陜西城固人； 教授，博士研究生導(dǎo)師； 研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物保護(hù)學(xué)。E-mail：yuechengxnd@aliyun.com