生長相關分子標記在翹嘴鱖五代中的富集

宋　易　梁旭方　田昌緒　呂麗媛　趙　程

（華中農業大學水產學院，農業部淡水生物繁育重點實驗室，湖北省淡水漁業協同創新中心，武漢 430070）

生長相關分子標記在翹嘴鱖五代中的富集

宋易梁旭方田昌緒呂麗媛趙程

（華中農業大學水產學院，農業部淡水生物繁育重點實驗室，湖北省淡水漁業協同創新中心，武漢 430070）

為進一步了解人工選育對翹嘴鱖生長相關遺傳標記的影響作用，研究以翹嘴鱖“華康1號”的5代選育群體為實驗材料，對具有生長相關優勢基因型的5個標記的6個位點進行擴增，通過直接測序和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種方法分型后，統計其優勢基因型個體數目在翹嘴鱖5代中的變化。結果顯示，在5代群體中，2個單核苷酸多態性位點和4個微衛星位點優勢基因型的數目的分布范圍為0—4，從F1到F5代，這6個位點優勢基因型的平均值分別為0.36、0.71、0.68、0.77和0.94，優勢基因型的平均含量隨選育世代的增加呈現遞增趨勢，從側面反映了人工選育在一定程度上富集了優良基因。此外，對微衛星位點進行了遺傳相似性和遺傳距離分析，結果顯示，隨著選育的進行，后續世代與F1的遺傳距離有明顯的增大趨勢，遺傳相似性減小，這符合育種的客觀規律。但相鄰世代間的遺傳距離則逐代減小，遺傳相似性逐代增大，說明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來了，這種相似性表現在表型上包括生長快、體重大、體長增加等。F1到F5代處于中度遺傳多樣性的穩定狀態，說明群體還存在選育空間。

優勢基因型；富集；微衛星；單核苷酸多態性；翹嘴鱖

翹嘴鱖（Siniperca chuatsi Basilewsky），俗稱季花、桂花，隸屬鱸形目（Perciformes）、暖鱸科（Percichthyidea）、鱖屬，是鱖屬魚類中體型最大、生長最快的一種鱖。其肉質堅實細嫩、味道鮮美、營養豐富、無肌間刺，是一種經濟價值很高的名貴品種，在我國淡水養殖業中占重要經濟地位［1］。隨著鱖養殖業的發展，其養殖規模不斷擴大，養殖密度不斷提高，水域生態環境不斷遭到人為破壞，加之飼養管理不善，使得鱖漁業資源大幅度減少，甚至成為偶見種［2］。因此，研究開發和保護翹嘴鱖資源越顯重要和迫切，開展翹嘴鱖的分子生物學研究，以揭示翹嘴鱖的遺傳特征，為漁業利用提供相關資料以及翹嘴鱖的人工養殖及資源保護提供科學依據。

標記輔助育種是分子生物學最有效的育種技術之一，近年來在越來越多的育種項目中，產業育種者已經通過這種技術獲得了生長顯著快的個體，從而減少了養殖群體一些經濟性狀的的丟失，包括生長速度、抗病率和存活率等［3，4］。但目前關于標記輔助育種的研究主要集中在序列位點的篩選，和篩選出的位點與性能的相關性分析方面［5—7］，而對篩選出的與性狀具有顯著性相關的位點在選育過程中的一個變化趨勢，卻很少有人進行過研究。本研究在已經選育出了生長快的翹嘴鱖5代群體的基礎上，對篩得的標記進行一個可靠性的驗證，以分析其用于輔助育種的可靠性。同時為進一步了解人工選育對翹嘴鱖生長相關遺傳標記的影響作用提供依據。實驗中用到的5代群體從F1到F5代，其生長速率依次增加［8，9］，在5代群體中對篩選到的分子標記的優勢基因型數目進行分析，研究結果可為標記輔助育種提供依據。

此外，由于優勢基因型的數量與相關性狀的顯著性存在正相關性，Kelly等［10］早在1995年就證實了基因聚合育種可以通過選育同時具有幾種抗性基因的個體而使其在抗性和生長速度上同時得到提高。因此，有研究者希望通過基因聚合育種加快育種進程，Servin等［11］提出要提高物種的某一性狀遺傳價值就要通過增加控制這一性狀的優勢基因數目來實現，Lange和Whittaker［12］以及Hayes和Goddard［13］也指出，通過將所有的有效標記用于同一群體的選育可以提高分子標記輔助育種的效率和成功率。在魚類中，徐磊等［14］通過對生長相關標記的優勢基因型含量分析發現大口黑鱸的生長速率與優勢基因型數目之間存在正相關性，而李紅霞等［15］在建鯉中也發現了相同的結論。因此，通過將某一性狀相關的基因或基因型聚合在一個群體上進行研究，能更好地反應出標記與性狀的相關性，提高標記用于輔助育種的效率。本實驗選取的2個多核苷酸多態性位點篩選自生長激素基因［4］，4個微衛星位點篩選自鱖轉錄組生長相關基因鄰近序列［16］，將它們結合起來進行研究是基因聚合育種科學性的體現。

此次研究在翹嘴鱖養殖5代群體共155個個體中進行來自不同基因序列位點的生長相關優勢基因型分析，在驗證前期篩選到的位點用于輔助育種的可靠性的同時，又通過來自不同基因序列的微衛星位點、單核苷酸多態性位點來進行綜合探究，得到的具有實際應用性的位點，可用于今后普通翹嘴鱖個體的選育工作中。

1　材料與方法

1.1材料

實驗魚來源于翹嘴鱖的5個連續選育世代，是湖北省淡水漁業協同創新中心從2008—2013年間連續選育出的世代群體，從F1到F5代的生長速率依次增加［8，9］。從每一個世代中隨機挑選31尾翹嘴鱖個體，共計155尾。剪取鰭條用95%的酒精保存，放入-20℃冰箱儲存。

1.2引物

實驗中用于優勢基因型分析的共有5對多態性引物均來自實驗室已發表文獻［4，16］，運用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計引物，引物由上海英駿完成合成，引物的詳細信息見表1。

表1　翹嘴鱖4對生長相關微衛星位點和1對生長相關SNPs位點的引物序列及特征Tab. 1　Primer sequences and characteristics of 4 growth-related microsatellites and growth-related SNPs of S. chuatsi（Basilewsky）

1.3方法

基因組DNA提取參照天根動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）說明書的介紹方法提取樣品基因組DNA，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光光度計檢測DNA質量和濃度，調整DNA終濃度到100 ng/μL后，-20℃保存。

PCR反應程序PCR反應總體積為50 μL，含有10×buffer 5 μL，dNTP（10 μmol/L） 1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，rTaq酶（北京康為世紀生物科技有限公司） 0.5 μL。在Biometra070-851PCR儀進行擴增，擴增程序為94℃預變性4min，然后30個循環，94℃變性30s，53.5—55.5℃復性45s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

PCR產物的檢測SSR產物檢測：PCR產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE緩沖液，120 V/cm電壓電泳。電泳結束后，取下凝膠用雙蒸水漂洗30s，后轉移至0.1%硝酸銀染色10min，再用雙蒸去離子水快速漂洗2次后，加入700 mL 顯影液顯色（含14 g氫氧化鈉，0.28 g碳酸鈉，2.8 mL 37%甲醛），待條帶顯現后，加入雙蒸水終止顯色。用Alpha Innotech402942凝膠成像系統掃描記錄。并用Alpha View SA軟件對每對微衛星引物擴增的等位基因分子量大小進行估算。

SNP產物檢測：將特異性好（瓊脂糖電泳條帶單一）的PCR產物送公司測序，獲得多態性位點序列信息。

1.4數據統計與分析

基因型的讀取微衛星分位點分型：根據每個個體產生的條帶位置確定其基因型，讀取各個個體的基因型，并記錄。

單核苷酸多態性位點分型：將獲得的序列信息用SeqMan軟件進行峰值讀圖，用MS-tools記錄每個群體中各個個體的位點的基因型，并記錄。

SNP位點優勢基因型的分型及生長相關性分析參見田昌緒等［4］的研究，采用直接測序的方法對群體進行基因型分型后，對各基因型與體重、體長、體高進行顯著性分析而得出其優勢基因型；SSR位點優勢基因型的分型及生長相關性分析參見易提林等［16］的研究，采用聚丙烯酰胺凝膠和銀染的方法對群體分型后，對基因型進行體重、體長、體高的顯著性分析而得出其優勢基因型。SNP位點g.4940A＞C、g.4948A＞T的優勢基因型為CC、TT，微衛星位點SC10、SC52、Sin135、AP34-23的優勢基因型為230/256、211/220、275/290、238/255。

基因型數目的統計分別在每代31個個體，共155個個體中統計其基因型數目，計算單核苷酸多態性位點g.4940A＞C、g.4948A＞T和微衛星位點SC10、SC52、Sin135、AP34-23的優勢基因型數目。

遺傳距離和遺傳相似性的計算基于微衛星標記的5個群體兩兩比較的遺傳相似度（S）和遺傳距離（D），按Nei［17］方法進行計算，運用軟件Mega 6.0進行計算，并分析其變化趨勢，計算公式：S= 2 Nxy/（Nx+ Ny）。

把電泳圖譜中任何一個個體在任意一泳道垂直方向顯示的帶紋記做“1”，而其他個體對應的位點缺少此帶則記做“0”，這樣可以得到各個個體的二進制數據信息的方陣。將上述二進制數據方陣用PhylTools 軟件計算獲得個體間遺傳距離矩陣；根據Nei 公式計算任意翹嘴鱖的遺傳相似度S以及遺傳距離D。

其中，Nxy為兩個體共享的圖帶數，Nx和Ny分別為x和y 個體擁有的圖帶數。一個群體（或品種、品系）內多個個體兩兩配對比較得到的S 值的平均值就反映了該群體內DNA 指紋圖相似程度或變異程度。

遺傳多態性的計算利用Popgen32軟件進行統計分析。計算出5個群體每個位點的等位基因數、有效等位基因數、基因觀測雜合度、基因期望雜合度等遺傳參數，分析其變化趨勢；

多態信息含量（Polymorphism information content，PIC）按BOTSTEIN等［18］的公式計算。

式中，Pi、Pj分別為第i個和第j個等位基因的頻率；n為等位基因頻率數目。

2　結果

2.1選育世代優勢基因型的富集

每個選育世代優勢基因型數目分布這5對引物在翹嘴鱖5代選育群體中表現出了良好的特異性和較高多態性，在155尾鱖DNA中擴增后，統計每代優勢基因型數目（表2）。

表2　翹嘴鱖每代個體優勢基因型數量的分布Tab. 2　The quantitative distribution of samples with different advantage genotypes of each generation

每個選育世代優勢基因型頻率分布根據上述統計的每個世代優勢基因型數目，計算每個世代的優勢基因型頻率（表3），由統計結果可知，從F1到F5，其優勢基因型頻率呈上升趨勢。

表3　翹嘴鱖每代優勢基因型總數頻率分布Tab. 3　The frequencies of total advantage genotypes in each generation of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

2.2五代群體遺傳距離分析

為研究選育對5代群體的遺傳結構的影響，計算了各群體的微衛星標記間的遺傳距離和遺傳相似度（表4）。結果顯示，隨著選育的進行，F5與F1的遺傳距離（黑體）有明顯的增大，遺傳相似性減小，這符合選育的客觀規律。但相鄰世代間的遺傳距離（黑體）則逐代減小，遺傳相似性逐代增大，說明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來了，這種相似性表現在表型上包括生長快、體重大、體長增加等。

表4　基于微衛星標記的翹嘴鱖選育世代群體遺傳相似度（右上角）和遺傳距離（左下角）Tab. 4　The genetic similarity ang genetic ditance based on microsatellite of the breeding generations of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

2.3五代群體遺傳多樣性分析

微衛星標記在5個群體中平均等位基因數、平均有效等位基因數、平均觀測雜合度和平均期望雜合度、平均多態信息含量（表5）。F1到F5代的PIC分別為0.5317、0.5611、0.5191、0.4248和0.4716，并沒有出現較大的波動，根據Botstein等［18］提出的當PIC＞0.5時，該位點為高度多態，當0.25＜PIC＜0.5時，該位點為中度多態，當PIC＜0.25時，則為低度多態。本研究隨機群體PIC處于中等多態水平，說明群體能維持自身的穩態，并存在選育空間。

表5　基于微衛星標記的翹嘴鱖選育世代群體遺傳多樣性參數Tab. 5　The diversity parameters based on microsatellite of the breeding generations of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

3　討論

3.1生長相關分子標記優勢基因型的富集

優勢基因型在選育群體“華康1號”中的富集結果表明，這6個位點優勢基因型平均值隨著群體生長速率的增加而增大，這些位點可作為翹嘴鱖普通個體選育中的可靠性標記用于將來的輔助育種中。這一結果對于魚類其他經濟性狀，比如肉質、適溫性等的選育工作也是十分有借鑒作用的，研究者可以將前期篩得的與性狀相關的位點在一個表型明顯的世代群體中進行驗證，若具有較好的特異性，且位點的性狀相關優勢基因型與世代群體的表型有顯著的相關性，則可大大提高這些標記用于后期輔助育種的成功率，減少一些因標記的不實用性造成的損失。優勢基因型以及基因聚合育種用于肉質、生長速率的選育工作前期已經有研究者在建鯉［19］和大口黑鱸［20］中進行過，也獲得了有效的性狀相關的標記，且徐磊等［14］也在其選育的大口黑鱸世代群體中對前期篩得的標記進行檢測，獲得了較好的檢測結果。

另外，孫效文等［21］在研究中發現，生長相關標記的數目與個體大小之間存在正相關性，也就是說含有效生長相關標記越多的個體，其生長速度越快。在這個事實的基礎上，本實驗結果中篩選到的標記的生長相關優勢基因型數目與世代群體的生長速度之間存在正相關性，就說明了這些位點與生長性狀相關聯的可靠性。類似的研究在其他水產動物中還不夠深入，只是停留在位點的篩選和性狀相關性分析層面。何焱等［22］在中華鱘的LPL 和HL基因上篩得了生長密切相關的SNP位點，彭敏燕等［23］在翹嘴鱖AMY基因上檢測到了SNP和SSR位點，并分析了其單倍型與攝食性狀的關聯性，陶文靜等［24］對生長激素受體基因進行了SNP位點篩選及增重相關性分析，但這些位點應用于后期輔助育種工作的仍十分少見，若對這些篩選到的位點進行類似的標記數目與個體表型之間的相關性分析，則可對其用于選育工作的可靠性進行驗證，促進這些標記在生產實踐中的應用，這對提高標記輔助育種的應用性是十分有意義的。

3.2生長相關基因的聚合育種

此外，本實驗的2個多核苷酸多態性位點篩選自生長激素基因［4］，4個微衛星位點篩選自鱖轉錄組生長相關基因鄰近序列［16］，這些位點優勢基因型的平均含量是對多個生長相關基因的聚合效果，能更全面地反應標記與表型之間的相關性。研究表明，動物的生長性狀都是受多個基因控制的［25］，因此，在不同基因序列上進行位點篩選和優勢基因型統計的多基因聚合分析，可以為了解多個基因作用于同一性狀的綜合作用奠定重要的基礎。多基因聚合分析在真菌系統分類［26］、雞肌肉脂肪性狀［27］和豬繁殖性狀［28］的研究中都已用到，但在魚類中的應用還不多，郭立等［29］進行了線粒體多基因聚合分析在鯔科魚類的譜系篩選及其效應探究，徐磊等［14］做了優勢基因型在大口黑鱸中的富集分析，此外，類似的聚類研究主要集中在地理分布［30］和外形分析［31］等方面，深入分子水平的聚合分析還有待進一步研究。而微衛星遺傳距離的分析說明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來了，這種相似性表現在表型上包括生長快、體重大、體長增加等，這是對人工選育作用的進一步驗證。F1到F5代的遺傳多樣性并沒有出現較大的波動，而是處于一個穩定的中等水平，說明群體既存在選育空間，又可以處于自身穩定的狀態。

綜上所述，分子標記輔助育種和基因聚合育種相結合的育種思路已經越來越受到關注。本研究中用到的生長激素基因已經得到較深入研究，許多研究者都在魚類里驗證了該基因的生長功能［32—35］。而翹嘴鱖“華康1號”5代選育群體具有從F1到F5生長速率依次增加的明顯表現型，在這樣的選育群體中對篩選到的分子標記的生長相關優勢基因型平均值進行分析，可以驗證標記用于輔助育種的可靠性，同時可以檢測人工選育對翹嘴鱖生長相關遺傳標記的影響作用。但是，選育出具有顯著表型的群體是一個較龐大的工程，群體的選育和標記的篩選是一個互相檢測的過程，若選育出表型顯著的群體，類似本實驗的研究便可開展，為篩選到更多可用于輔助育種的標記提供可靠的實驗材料，同時大大減少了育種的工作量。另外，從研究較透徹的性狀相關功能基因上去篩選標記，也可大大提高標記的可靠性［36］，候選基因法近些年在人類疾病、鳥類遷徙適應性和谷物含鋅量、抗病性等方面都得到應用［37—39］，在水產動物上的發展也在推進［40—43］。多基因、多標記的聚合分析已經是育種的必然趨勢，而獲得表型顯著的群體后，這種分析又可變得更快、更容易實現了。

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PYRAMIDING OF GROWTH-RELATED MARKERS IN FIVE BREEDING GENERATIONS OF SINIPERCA CHUATSI BASILEWSKY

SONG Yi，LIANG Xu-Fang，TIAN Chang-Xu，Lü Li-Yuan and ZHAO Cheng
（Key Lab of Freshwater Animal Breeding，College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Ministry of Agriculture，Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province，Wuhan 430070，China）

Gene pyramiding breeding is based on the effect of polygenic polymerization to change correlated character. In previous studies，growth-related markers were found in Siniperca chuatsi. Among them，five markers with six growth-favorable genotypes were selected，including two sites of single nucleotide polymorphism（SNP） located in GH gene and four sites of microsatellite（SSR）：SC10，SC52，Sin135 and AP34-23. To get deeper insight into the effect of artificial breeding on growth-related markers identified in previous studies，we analyzed the number of favorable genotypes of these markers in five breeding generations of Siniperca chuatsi，‘Huakang No.1'. By direct-sequencing and polyacrylamide gel electrophoresis，we found that the sum of two SNP favorable genotypes and four SSR favorable genotypes appeared pyramiding. The result showed that the number of total favorable genotypes ranges from 0 to 4 in the tested fishes. The average contents were 0.36，0.71，0.68，0.77，0.94 in F1，F2，F3，F4 and F5 generations，respectively，showing the number of favorable genotypes increased synchronously with the growth rate of the populations，which reflects that，artificial breeding has aggregated favorable genotypes in some degree. The SSR analysis showed that，when compared with F1，the genetic distances increased from F2 to F5 while the genetic similarity decreased，which observed objective law. When compared with its contiguous generation，the genetic distances decreased from F1 to F5 while the genetic similarity increased. The analysis of the genetic distances indicated that artificial breeding has conserved individuals of higher genetic similarity，which in performance have phenotypes of fast growth，heavier body weight or longer body length. The genetic diversity shows no large fluctuations，but a state of stability，which indicated further space for breeding.

Favorable genotype； Pyramiding； SSR； SNP； Siniperca chuatsi Basilewsky

G344+.1

A

1000-3207（2016）05-0951-07

10.7541/2016.123

2016-03-30；

2016-05-05

國家自然科學基金項目（31272641）； 珠江流域高產精養池塘健康養殖技術與示范（2012BAD25B04）； 中央高校基本科研業務費（2662015PY041，2015BQ040）專項資助 ［Supported by the Science Foundation of China（31272420）； the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program（2012BAD25B04）； the Fundamental Research Funds for the Central Universities（2662015PY041，2015BQ040）］

宋易（1991—），女，湖北咸寧人； 在讀碩士生； 研究方向為魚類遺傳與育種。E-mail：15902792427@163.com

梁旭方（1965—），男，博士，教授； E-mail：xufang_liang@hotmail.com