斧文蛤金屬硫蛋白基因的克隆與表達分析

蔣國萍　程雪艷　滕爽爽　柴雪良，　林興管　劉廣緒　肖國強

（1. 浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 2. 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，溫州 325005；3. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 4. 溫州醫科大學檢驗醫學院，生命科學學院，溫州 325005；5. 浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

斧文蛤金屬硫蛋白基因的克隆與表達分析

蔣國萍1，2，3程雪艷1，2，4滕爽爽1，2柴雪良1，2，3，4林興管1，2劉廣緒5肖國強1，2

（1. 浙江省海洋水產養殖研究所，溫州 325005； 2. 浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，溫州 325005；3. 上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306； 4. 溫州醫科大學檢驗醫學院，生命科學學院，溫州 325005；5. 浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類富含半胱氨酸的小分子蛋白質，參與機體重金屬解毒、維持金屬元素代謝平衡以及清除自由基等生理功能。為了解斧文蛤金屬硫蛋白（Ml-MT）的分子生物學特征及其在重金屬Cd2+脅迫下的響應機制，本文采用RACE技術從斧文蛤（Meretrix lamarckii）總RNA反轉錄產物中獲得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。該序列包含65 bp的5′非編碼區（UTR）和340 bp的3′非編碼區（UTR）以及231 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼76個氨基酸； 其中半胱氨酸占27%，不含芳香族氨基酸，含16個MT所特有的Cys-Xn-Cys結構，預測的分子量約為7.704 kD，理論等電點7.138。MT氨基酸序列比對分析表明：斧文蛤金屬硫蛋白（Ml-MT）與麗文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高達88%，與文蛤（Meretrix meretrix）的同源性為87%。實時熒光定量（qRT-PCR）檢測MT在斧文蛤5種組織中均有表達，但存在組織特異性，其中內臟團表達量最高，其次依次為鰓絲、閉殼肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）脅迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下，斧文蛤內臟團MT呈現出不同程度的上調表達，具體表現為“高-低-高-低”的波浪式變化，除6h以外，其他時間點均與對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。本研究表明：MT基因在維護機體正常生理功能及斧文蛤抵御重金屬Cd2+脅迫過程中發揮著重要的分子調控作用。

斧文蛤；金屬硫蛋白；基因克隆；表達分析；Cd2+

斧文蛤（Meretrix lamarckii）隸屬于瓣鰓綱（Lamellibranchia）、簾蛤目（Veneroida）、簾蛤科（Veneridae）、文蛤屬（Meretrix），是我國沿海重要的海水經濟貝類種類之一［1］。斧文蛤營埋棲型生活、靠濾水進行呼吸及取食［2，3］，因此可能極易受到環境重金屬的污染脅迫。金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類低分子量，富含半胱氨酸，有豐富的Cys-X（1-3）-Cys（X為除半胱氨酸以外的其他氨基酸）結構域的特異性結合蛋白［4］。MT廣泛存在于生物體內、能被金屬離子、氧化損傷以及免疫刺激等多種因素誘導，參與生物體內金屬水平的穩態調節、自由基清除、重金屬解毒等生物學功能［5］。研究表明：MT的表達水平能夠間接反映生物體對環境的應激反應情況以及對重金屬的解毒能力，因此常用于評價重金屬的污染狀況和生物體的適應能力［6］。目前，MT已被聯合國環境規劃署遴選為海洋環境監測的生物標志物之一［7］（UNEP/RAMOGE）。

早在1979年，Ridlington等［8］在美洲牡蠣（Crassostrea virginica）中報道了軟體動物的首個MT序列，此后陸續在紫貽貝（Mytilus edulis）［9］、海灣扇貝（Argopecten irradians）［10］、青蛤（Cyclina sinensis）［11］和菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）［12］等多種軟體動物體中發現了MT的存在。然而，關于斧文蛤的MT基因及表達尚未見報道。本研究以斧文蛤為實驗對象，利用RACE技術克隆Ml-MT基因全長cDNA序列，利用生物信息學手段分析了Ml-MT的分子特性，通過實時熒光定量技術（qRT-PCR）研究其在斧文蛤不同組織的表達差異，并探究Cd2+暴露對斧文蛤MT基因表達的影響，研究結果可為探討斧文蛤MT解毒機理和功能提供一定的參考資料。

1　材料與方法

1.1實驗材料

試驗所用斧文蛤取自浙江省海洋水產養殖研究所清江實驗基地［殼長（40.19±1.63） mm］，實驗室內暫養7d ［鹽度30±1，pH為8.20±0.05，溫度（22±2） ℃］，選擇閉殼反應靈敏個體進行實驗。暫養過程中保持連續充氣，每24h換水1次，且每12h投喂約5×104cell/ mL的球等鞭金藻（Isochrysis galbana）。

1.2斧文蛤金屬硫蛋白基因的克隆

斧文蛤總RNA提取及cDNA制備利用RN28試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取總RNA，Nanodrop2000超微量核酸分析儀檢測RNA的濃度和純度，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，通過M-MuLV（美國Promega公司）反轉錄試劑盒獲得cDNA，置于-80℃超低溫冰箱中備用。

Ml-MT基因的同源克隆采用同源克隆的方法，利用NCBI數據庫中文蛤（GU233466.1）、麗文蛤（AY525635.1）、河蜆（EF185126.1）、硬殼蛤（JQ691633.1）、菲律賓蛤仔（KF241789.1）和紫貽貝（AJ005452.1）MT基因的核苷酸序列進行多序列比對，并用Bioedit和Oligo 6.0軟件在保守區域內設計簡并引物MT-F1和MT-R1（表1）。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，并用GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）回收純化后，送至上海生工生物工程技術有限公司測序，獲得了226 bp大小的擴增產物，BLAST分析結果表明該序列為金屬硫蛋白基因的部分序列。根據該部分序列，利用Oligo7軟件設計RACE特異性引物：3-RACE-F1、3-RACE-R1，3-RACE-F2、3-RACE-R2和5-RACEF1、5-RACE-R1，5-RACE-F2、5-RACE-R2（表1），分別用于MT基因的3′端和5′端的RACE擴增。為了提高擴增PCR的特異性，3′端和5′端的RACE擴增均采用巢式PCR擴增技術。PCR擴增產物經過純化、檢測、割膠回收之后送至上海生工生物工程技術有限公司測序。

Ml-MT基因的克隆與鑒定為保證斧文蛤MT基因cDNA序列的正確性，根據拼接全長設計引物MT-F、MT-R（表1）用于全長克隆與鑒定，將PCR擴增產物純化后連接到pMDTM19-T Vector（TaKaRa）載體上，轉化到Trans1-T1 Phage Resistant感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司）內，經LB平板（含Amp+）培養以及M13和特異性引物的菌液PCR篩選后，挑選陽性克隆菌送往上海生工生物工程技術有限公司測序。

表1　斧文蛤MT基因克隆與表達的引物序列Tab. 1　The gene cloning and primer sequence expression on the metallothionein of M. lamarckii

1.3斧文蛤金屬硫蛋白基因的組織差異性表達

為檢測Ml-MT mRNA在不同組織器官的表達水平，取5只健康的斧文蛤，解剖取其內臟團、鰓絲、外套膜、斧足和閉殼肌5個組織部位，分別提取各個組織的RNA，進行Real time-PCR。

1.4斧文蛤在Cd2+脅迫下金屬硫蛋白基因的表達變化

根據前期Cd2+脅迫斧文蛤急性攻毒結果［13］以及參照其他相關研究［14］取合適的Cd2+濃度0.13 mg/ L，另設置不添加Cd2+為空白對照，脅迫處理96h，期間正常充氣不投餌，分別于0、6h、12h、24h、48h、72h和96h取樣。每次實驗組和對照組各取5只斧文蛤，解剖取其內臟團，分別提取RNA，按照Promega反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成。根據已獲得的Ml-MT基因cDNA全長序列，設計熒光定量引物RT-MT-F和RT-MT-R（表1）； 以斧文蛤βactin（GenBank：KT448844）作為內參基因用于模板的校正，設計引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。反應在Applied Biosystems StepOne PlusTM實時定量PCR儀上進行，反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性 5s，60℃退火30s，40個循環； 95℃反應15s，60℃反應60s，95℃反應15s（制備熔解曲線）。

1.5生物信息學分析和數據處理

用ExPASy（http：//web.expasy.org/translate/）在線翻譯MT基因序列、推斷其開放閱讀框序列和編碼的氨基酸序列； 用DNAStar軟件中的EditSeq程序推斷MT蛋白的分子量、等電點等； 用SignalP 4.1Server在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測分析信號肽； 利用DNAStar中MegAlign程序對已獲得的斧文蛤MT與其他雙殼貝類MT的氨基酸序列進行多序列比對； 采用MEGA 6.0軟件中的鄰位相接法（NJ法）對不同物種的MT氨基酸序列構建系統進化樹，設置Bootstrap的值為1000。

熒光定量數據處理采用2-ΔΔCt法計算［15］。實驗數據采用SPSS19.0進行T檢驗，*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01表示差異極顯著。

2　結果

2.1斧文蛤MT基因的克隆及序列分析

將簡并引物擴增的部分序列、5′ 端RACE克隆序列和3′ 端RACE克隆序列用DNAStar軟件中的Seqman程序拼接并全長克隆、測序、驗證獲得了斧文蛤MT基因的全長cDNA序列（GenBank登錄號：KT448843）。斧文蛤MT基因的cDNA序列全長636 bp，其中開放閱讀框231 bp（66—296 bp），5′ 端UTR為65 bp（1—65 bp），3′ 端UTR為340 bp（297—636 bp）具有多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和polyA尾巴； 共編碼76個氨基酸，其中半胱氨酸占27%，包含16個金屬硫蛋白典型的Cys-X（1—3）-Cys結構。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

通過DNAStar軟件Editseq程序預測分析：斧文蛤MT蛋白序列包括9個強堿性氨基酸（K、R），10個強酸性氨基酸（D、E），6個疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V），38個極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），蛋白的分子量約為7.138 kD，理論的等電點PI= 7.0。經SignalP 4.1 Server在線軟件預測分析顯示：該蛋白沒有明顯的信號肽，也沒有跨膜區域，為胞內蛋白。

經BLAST比對分析，Ml-MT編碼的氨基酸與其他雙殼貝類的MT蛋白具有較高的相似性。其中與麗文蛤（M. lusoria）、文蛤（M. meretrix）的MT蛋白相似性高達88%和87%，與河蜆（Corbicula fluminea）和硬殼蛤（M. mercenaria）MT蛋白的相似度也在70%以上，與其他雙殼貝類也有較高的同源性。為了進一步研究斧文蛤與其他物種的MT系統進化關系，采用MEGA 6.0軟件中鄰位相連法（Neighbor-joining）構建斧文蛤與其他雙殼貝類和人（Homo supiens. AAP97267.1）、小家鼠（Mus musculus. AAQ24163.1）、果蠅（Drosophila melanogaster. AGB95820.1）、原雞（Gallus gallus. NP_990606.1）、非洲爪蟾（Xenopus laevis. NP_001081042.1）、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense. AJA05010.1）以及斑馬魚（Danio rerio. AAS00514.1）等16種MT氨基酸序列的系統進化樹（圖1）。從系統進化樹可以看出整個進化樹分為兩大支，哺乳類、兩棲類、鳥類、魚類聚為脊椎動物一支，而果蠅類與其他雙殼貝類聚為無脊椎這一支；其中斧文蛤與麗文蛤（M. lusoria. AAS928771）親緣關系最近，文蛤（M. meretrix. ADM96223.1）次之，與哺乳類的親緣關系較遠，Ml-MT的分子進化地位與斧文蛤的生物學分類地位基本一致。

2.2斧文蛤 MT 基因組織表達差異

采用RT-qPCR法，檢測斧文蛤成貝在自然狀態下內臟團、鰓絲、外套膜、斧足、閉殼肌5種組織中MT在mRNA水平的表達狀況見圖2（各組織的MT基因表達量是相對于斧足MT基因的表達量）。結果顯示，MT在斧文蛤各組織中均有表達，但存在組織特異性，表達量依次為內臟團＞鰓絲＞閉殼肌＞外套膜＞斧足。除外套膜外，斧足MT表達量與其他組織存在不同程度的差異（內臟團、鰓絲：P＜0.01，極顯著； 閉殼肌：P＜0.05，顯著）。

圖1　根據金屬硫蛋白氨基酸序列使用NJ構建的系統進化樹Fig. 1　The NJ phylogenetic tree of vertebrate based on the amino acid sequences of M. lamarckii

圖2　斧文蛤5種組織中MT mRNA的差異性表達Fig. 2　The different expressions of MT mRNA in five tissues of M. lamarckii

2.3斧文蛤MT基因在 Cd2+脅迫下的表達影響

如圖3所示，與對照組（Cd2+：0.00 mg/L）實驗期間MT表達量變化不大相比，實驗組內臟團MT隨Cd2+脅迫時間的延長呈現出不同程度的上調表達，具體表現為“高-低-高-低（0—48h、48—96h）”的波浪式變化。6h開始緩慢上升，24h和72h為兩輪峰值，分別是對照組的7.1和7.4倍。之后緩慢下降； 整個試驗期間Ml-MT的表達量均高于對照組，除6h以外其他時間點均與對照組存在極顯著差異（P＜0.01）。

3　討論

3.1斧文蛤MT基因生物信息學分析

金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體內多功能誘導性的小分子蛋白超家族，其主要功能是調節必需金屬元素的穩定和非必需金屬元素的解毒［16—18］。關于MT解毒機理推測認為：一方面，結構決定功能可能是由于金屬進入生物體內以后，可迅速啟動MT基因的特異性金屬應答反應、提高mRNA 轉錄水平合成大量MT蛋白，通過保守Cys中巰基（-SH）螯合金屬離子形成復合物減輕毒性，同時清除由此作用產生的自由基等最終達到解毒目的［19］； 另一方面，或者通過參與和介導一系列的酶促反應、信號傳遞和基因調節引起相關基因的表達變化，從而起到解毒作用維持生物體正常的生理活動［20］。本研究通過RACE技術，克隆獲得了斧文蛤Ml-MT的全長cDNA序列，共編碼76個氨基酸，其中半胱氨酸占27%。此外，Ml-MT編碼的蛋白含有16個MT特有Cys-X（1-3）-Cys結構，并且具有軟體動物MT蛋白的Barcoding（CKCXXXCXCX）。與軟體動物MT 編碼的氨基酸比對發現Cys殘基分布高度保守。從進化樹中可以發現，兩棲、魚類、鳥類以及哺乳類動物的MT最后聚為脊椎動物一支，而Ml-MT最后聚到無脊椎動物中的軟體動物一支。預示著金屬硫蛋白受體蛋白有著共同的祖先，只是隨著時間推移，動物進化分化出了不同類型的受體蛋白。

3.2斧文蛤MT基因組織表達特異性分析

Ml-MT不同組織qRT-PCR特異性表達中發現：雖然其在所檢測的組織中都有表達，但存在一定的組織差異性，其表達量依次為內臟團＞鰓絲＞閉殼肌＞外套膜＞斧足。該結果與其他研究結果相類似［21，22］。這可能由于內臟團是主要的消化和解毒器官，具有較強的抗氧化能力，對重金屬有很強的蓄積和代謝能力； 鰓絲作為呼吸濾食器官直接暴露污染水體中，因此MT表達量也相對較高； 閉殼肌作為收縮防御器官，對外界刺激比較敏感，由于應激反應會快速收縮關閉雙殼達到自我保護的目的； 外套膜和斧足可能是雙殼關閉以后，腔內殘留污染水體，外套膜接觸面積大于斧足，故斧足表達量最低。但有研究顯示：斧足表達量大于外套膜和閉殼肌［23］，認為斧足是鉆掘器官，長期接觸污染泥沙，故MT表達量比較高，這可能是生物體長期生活的環境和習性不同所造成。

3.3斧文蛤MT基因在Cd2+脅迫下的表達分析

Cd2+是生物生命活動中的非營養元素，其原子結構使之極易進入生物組織和細胞并同酶蛋白活性中心的巰基（-SH）結合，引起酶空間構象改變，導致酶活性下降，代謝紊亂，成為致毒的根源［24］。而MT被認為是生物體在遭受重金屬脅迫后最先參與重金屬解毒和代謝的生物大分子［25］。已有研究發現，MT基因的表達量與生物體內重金屬濃度和脅迫時間具有明顯的正相關性。例如，隨 Cd2+暴露濃度增大和時間的延長，長牡蠣（C. gigas）消化腺和鰓組織中MT轉錄本的表達量顯著升高［26］。鑒于不同組織Ml-MT的差異性表達和已往研究經驗［22］，本文選取斧文蛤內臟團為對象，研究Cd2+脅迫斧文蛤不同時間下Ml-MT mRNA的相對表達變化。結果發現：Ml-MT mRNA隨著時間的延長呈現出不同程度的上調表達，具體表現“高-低-高-低”的波浪式變化，該結果與其他研究結果相類似［22，27—29］。其原因推測可能是：重金屬Cd2+進入生物體內臟團后，產生一個毒物脅迫刺激，誘導MT基因超常表達，致使MT的表達量迅速升高，合成大量的MT蛋白與Cd2+結合； 當MT的表量達到較高的濃度時，能夠滿足重金屬解毒的需求，MT基因恢復到正常表達水平； 但隨著合成的MT蛋白與內臟團中重金屬的源源不斷結合，MT表達量逐漸下降到較低水平，無法滿足隨之增加的重金屬毒性脅迫，新一輪MT基因的超常表達又被激起，隨之也產生更高的mRNA相對表達，從而導致了全程MT基因相對表達量呈現“高-低-高-低”的波浪變化。Paul-Pont等［29］在研究歐洲鳥尾蛤（Cerastoderma edule）時發現：Cd2+暴露水體中，鰓中Cemt1基因在攻毒后24h和168h時有較高的表達水平，而在72h的誘導則被顯著抑制，稱之為“脈沖式波動”。而本研究中卻沒有出現抑制現象，僅隨脅迫時間的延長呈現出不同程度的上調表達，除6h以外，其他時間點均與對照組存在極顯著差異（P＜0.01），這可能與本實驗所用的安全濃度SC（Cd2+：0.13 mg/L）有關，Cd2+產生的毒性脅迫在斧文蛤MT解毒承受范圍之內，故沒有出現抑制脅迫現象。研究表明：MT基因誘導水平往往受多種因素影響，存在溫度效應關系、劑量效應關系和時間效應關系等［30，31］，因此，在探討MT mRNA作為環境重金屬污染指標的研究中，要綜合考慮多種影響因素。

圖3　斧文蛤內臟團MT基因在重金屬鎘脅迫下不同時間相對表達量的變化Fig. 3　The relative expression of MT in liver of M. lamarckii under Cd2+stress at different times

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In this study，by using RACE technology to gain 636 bp of metallothionein（Ml-MT） gene cDNA sequences from total RNA reverse transcription product. The sequence contains 65 bp of 5′ Untranslated Region（UTR） and 340 bp of 3′ UTR in addition to 213 bp of the open reading frame（ORF），which can encode 76 amino acids. Of this，accounting for 27% cysteine，no aromatic amino acids and there are 16 MT of the specific Cys-Xn-Cys structure，where the molecular weight and theoretical isolectric point were predicted to be 7.704 kD and 7.138 respectively. The MT amino acid sequence alignment comparative analysis indicated that the M. lamarckii and Meterix lusoria were similar at more than 88%，with M. meretrix homology of 87%. The quantification real-time PCR（qRT-PCR） detection showed that there were MT expressions in five kinds of tissue of M. meretrix. These expressions had tissue specificity where visceral mass had the highest levels，followed by the Gill filaments，adductor muscle，mantle and foot. In Cd2+0.13 mg/L exposures of 0，6h，12h，24h，48h，72h and 96h，the MT mRNA of M. meretrix visceral mass displayed different increasing degrees of contamination time. Specific performance is “high-low-high-low” wave trend changes. Except for 6h，the other time points compare with control group have significant difference（P＜0.01）. This study showed that MT gene in the maintenance of normal physiological function of the body play an important role of molecular regulation in Cd2+stress of M. meretrix.

CLONING AND EXPRESSION OF METALLOTHIONEIN GENE IN MERETRIX LAMARCKII

JIANG Guo-Ping1，2，3，CHENG Xue-Yan1，2，4，TENG Shuang-Shuang1，2，CHAI Xue-Liang1，2，3，4，LIN Xing-Guan1，2，LIU Guang-Xu5and XIAO Guo-Qiang1，2
（1. Zhejiang Mari-culture Research Institute，Wenzhou 325005，China； 2. Zhejiang key lab of Exploitation and presevation of coastal Bio-Resource，Wenzhou 325005，China； 3. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China； 4. Laboratory Medicine and Life Science College of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325005，China；5. College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

Metallothionein（MT） is a family of cysteine-rich，low molecular weight proteins. It involves heavy metal detoxification，maintain metabolic balance free radical scavenging metal elements and other physiological functions. A large number of studies show that the expression level of MT can indirectly reflect the stress response of organisms to the environment and the ability of detoxification of heavy metals. As a result，it is often used to evaluate the pollution status of heavy metals and the adaptability of organisms to these heavy metals. Therefore，MT presently has been selected as one of the biomarkers of marine environmental monitoring by the United Nations Environment Program.

Meretrix lamarckii； Metallothionein； Gene cloning； Expression； Cd2+

S917.4

A

1000-3207（2016）05-0914-07

10.7541/2016.05.118

2015-09-07；

2016-01-21

海洋公益性行業科研專項（201205021-5）； 國家貝類產業技術體系（CARS-48）； 國家自然科學基金面上項目（31372503）； 水產種質資源平臺運行服務（2015DKA30470）資助 ［Supported by Scientific Research Projects of Marine Public Welfare Industry（201205021-5）； National Shellfish Industry Technology System（CARS-48）； Project of the National Natural Science Foundation of China（31372503）； Aquatic Germplasm Resources Platform Operation Service（2015DKA30470）］

蔣國萍（1989—），女，安徽宿州市人； 研究生； 主要從事海洋酸化與灘涂貝類生態學研究。E-mail：jgp1126090790@163.com

肖國強（1978—），男，江蘇鎮江市人； 副研究員； 主要從事生態生理學研究。E-mail：xiaogq1978@163.com