赤眼鱒Toll 樣受體3基因cDNA全長克隆及表達分析

肖調義　李　偉　王榮華　劉巧林　彭慧珍　蘇建明

（1. 湖南農業大學，湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心，長沙 410128； 2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心，常德 415000； 3. 湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128）

赤眼鱒Toll 樣受體3基因cDNA全長克隆及表達分析

肖調義1，2李偉1王榮華1劉巧林1，2彭慧珍1，2蘇建明1，3

（1. 湖南農業大學，湖南省特色水產資源利用工程技術研究中心，長沙 410128； 2. 水產高效健康生產湖南省協同創新中心，常德 415000； 3. 湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128）

為探究赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus） Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，ScTLR3）基因是否參與抗病毒免疫反應，實驗運用RACE技術，克隆得到ScTLR3基因cDNA全長序列，并進行了生物信息學分析； 通過Real-Time qPCR技術，檢測了ScTLR3 mRNA在健康赤眼鱒10個組織中的分布以及感染草魚呼腸孤病毒（GCRV）后肝臟、脾臟、體腎和頭腎中的表達特征。結果表明：ScTLR3基因cDNA序列全長4043 bp，包括5′-非編碼區（UTR） 216 bp，開放閱讀框（ORF）2715 bp和3′-UTR 1112 bp； ScTLR3共編碼904個氨基酸殘基，推導的蛋白分子量102.67 kD，理論等電點8.76； SMART結構域預測顯示，ScTLR3由N端的信號肽（SP）、富亮氨酸結構域（LRRs）、跨膜結構域（TM）和C端的Toll/白介素-1受體結構域（TIR）組成。實時熒光定量結果顯示，ScTLR3 mRNA在檢測的各組織中均有表達，肝臟中的相對表達量極顯著高于其他組織（P＜0.01）； 感染GCRV后，肝臟、脾臟、體腎和頭腎組織中ScTLR3 mRNA均上調表達，肝臟、脾臟和體腎組織中的相對表達量在24h達到峰值，分別為對照組的5倍、7倍和6倍。研究表明，ScTLR3具有TLRs家族基因的典型結構特征，并能被GCRV誘導表達，推測其在赤眼鱒抗GCRV入侵免疫反應中發揮了重要作用。

赤眼鱒；Toll樣受體3；分子克隆；表達特征

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是一類識別病原體保守結構——病原相關分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）［1，2］。自1985年在果蠅中被發現起，TLRs基因受到廣大研究者的關注［3］。魚類中首個TLRs基因由Sangrador-Vegas等［4］2000年從虹鱒（Oncorhynchus mykiss）cDNA文庫中克隆得到。TLR3同時存在于哺乳動物和魚類，位于細胞質核內體上，參與雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）的識別，是抗病毒免疫反應和免疫機制進化研究的理想對象［5，6］。

目前，已有多種魚類的TLR3基因的cDNA序列、識別配體及功能被報道，如稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）［7］、草魚（Ctenopharyngodon idella）［8］、斑馬魚（Danio rerio）［9］、鯽（Carassius auratus）［10］、河豚（Fugu rubripes）［11］、虹鱒（O. mykiss）［12］、南亞野鯪（Labeo rohita）［13］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［14］等。研究顯示，草魚呼腸孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV）感染稀有鮈鯽［7］或傳染性造血壞死病病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）感染虹鱒［12］后，相關組織中TLR3表達量均顯著上調，且dsRNA病毒類似物poly（I：C）同樣能誘導虹鱒巨噬細胞［12］、人胚腎293細胞［15］和大黃魚脾臟［16］中TLR3顯著上調表達。另外，細菌也能引起魚類TLR3基因的表達水平變化［16，17］。魚類TLR3的功能與哺乳動物相似，在免疫反應中富亮氨酸結構域（Leucine-rich repeats，LRRs）與病毒dsRNA特異性結合并通過MyD88非依賴信號轉導途徑，激活相關信號因子，誘導干擾素的產生［18，19］。研究表明，Ⅰ型干擾素通過促進下游干擾素刺激基因（MX1、TRIM等）表達，從而抑制病毒的繁殖［20，21］。

近年來，草魚出血病嚴重影響草魚養殖業的發展，其病原GCRV受到廣泛關注［22］。赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）與草魚親緣關系較近，同屬雅羅魚亞科，分屬赤眼鱒屬和草魚屬，其作為一種優質的淡水經濟魚類，亦被大量研究報道［23］。劉巧林［24］用GCRV感染赤眼鱒和草魚后發現，赤眼鱒存活率較草魚高一倍以上。為探究ScTLR3基因是否參與赤眼鱒抗病毒免疫反應，本實驗克隆了ScTLR3基因cDNA全長，并對其進行生物信息學分析，同時檢測了ScTLR3 mRNA在赤眼鱒各組織中分布和感染GCRV后肝臟、脾臟、體腎和頭腎組織中的表達特征，為進一步研究其結構和功能提供線索和參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料

實驗用赤眼鱒購自瀏陽市北盛鎮烏龍漁場（湖南長沙），為2014年5月繁育個體，實驗前培育于面積333 m2，水深1 m的池塘。選取180尾6月齡的健康赤眼鱒［體長（8.45±0.74） cm，體重（12.33±1.34） g］，于80 L/箱的恒溫循環水養殖系統28℃養殖4周，30尾/箱，每天定時光照12h并按照體重的1%投喂粗蛋白含量為30%的膨化飼料2次。

本實驗用GCRV（106毒株，1.78×107TCID50/mL）由中國水產科學研究院長江水產研究所曾令兵研究員惠贈。

1.2實驗方法

總RNA提取和第一鏈cDNA合成選取一尾健康赤眼鱒，丁香酚（國藥，上海）麻醉處理后，用無核酸酶勻漿管（Bertin，法國）分別收集約80 mg腎臟和脾臟組織（預先加入5粒0.8—1.0 mm陶瓷研磨珠和600 μL裂解液，并在冰上預冷），立即用均質儀Precellys 24（Bertin，法國）勻漿，勻漿程序：5000 r/ min，15s/次，共2次，間隔5s，總RNA提取的其他步驟參考MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，大連）說明書。將總RNA分裝成3份，分別用于RNA濃度（純度）檢測、穩定性（完整性）檢測和第一鏈cDNA及RACE cDNA合成。使用BioSpectrometer Basic核酸蛋白儀（Eppendorf，德國） 檢測總RNA濃度（純度），穩定性（完整性）檢測步驟：1%瓊脂糖凝膠電泳對比分析置于-70℃和37℃的總RNA樣品，28S∶18S條帶亮度約等于2∶1且無明顯變化的樣品視為穩定（完整）的。使用First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，美國）試劑盒，以Oligo（dT）18為引物、約2 μg總RNA為模板，按照說明書進行第一鏈cDNA合成，產物-20℃儲存備用。

cDNA 部分序列克隆根據GenBank中草魚（DQ864497.1）、團頭魴（DQ986365.1）、斑馬魚（AY616582.1） TLR3基因cDNA序列保守區設計2對同源PCR引物F1/R1、F2/R2（表1），克隆ScTLR3基因cDNA部分序列，50 μL PCR反應體系由：赤眼鱒脾臟和肝臟cDNA各0.5 μL、0.25 μL TaKaRa Ex Taq（TaKaRa，大連）、5 μL 10×Ex Taq緩沖液、4 μL dNTP 混合液、正反引物（10 μmol）各1 μL和37.75 μL Mili-Q等級水組成，擴增程序：95℃ 5min； 95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，25 cycles； 72℃ 7min； 4℃ 保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳純化后采用Gel Extraction Kit（Omega Bio-Tek，美國）回收，產物連接pEGM-T easy載體（Promega，北京），選取2個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1　本研究相關引物Tab. 1　Primers used in this study

末端快速擴增（RACE）依據SMARTer RACE 5′/3′ Kit（Clontech，美國）用戶手冊，應用Oligo7軟件以拼接的ScTLR3基因部分cDNA序列為模板，設計RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer以及RACE內引物GSP-5′-inner和GSP-3′-inner（表1），同時分別制備5′RACE cDNA和3′RACE cDNA。使用RACE外引物GSP-5′-outer和GSP-3′-outer分別進行5′或3′第一次PCR，電泳檢測首次PCR產物，若無目的條帶，使用50倍稀釋的首次PCR產物和相應的RACE外引物進行巢式PCR，兩次PCR的反應體系和反應程序均同用戶手冊。目的片段經1%瓊脂糖凝膠電泳純化后使用In-Fusion?HD Cloning Kit（Clontech，美國）連接，選取3個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列經SeqMan軟件拼接后，得到ScTLR3的cDNA全長序列。

序列分析應用ExPASy-Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）預測ScTLR3開放閱讀框（ORF），并推導其編碼的氨基酸序列。對推導的氨基酸序列進行生物信息學分析：分子量和等電點應用在線工具ExPASy-Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算； 在線軟件SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）被用來預測信號肽； 結構域預測使用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）； ITASSER（http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER/）被用于氨基酸序列3D建模，其數據分析和圖表構建采用PyMOL 2.7軟件； 使用MEGA 6.06軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining） 構建TLR3系統進化樹。

組織表達分析選取3尾健康赤眼鱒，分別提取心臟、腦、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、肌肉、腸、鰓和胸腺10個組織的總RNA，并合成第一鏈cDNA。根據ScTLR3保守區設計特異的熒光定量引物（ScTLR3-Q-F/R，E=96.64%），以β-actin作為內參基因設計引物（actin-F/R，E=95.37%）（表1）。利用CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）進行實時熒光定量PCR檢測，20 μL反應體系由10 μL 2×UltraSYBR Mixture（康為世紀，北京）、上下游引物各0.4 μL和9.2 μL 10倍稀釋的cDNA組成。反應條件為95℃ 10min； 95℃ 5s，60℃ 10s，72℃ 10s，采集熒光，35 cycles； 溶解曲線從65℃上升至95℃，每5s上升0.5℃，采集熒光。每個樣品進行3次重復。

病毒感染和表達特征分析GCRV攻毒實驗設實驗組和對照組，均設3個重復，每個重復30尾。實驗組腹腔注射GCRV病毒懸液200 μL/尾，對照組注射等量磷酸緩沖液（PBS）。在注射后的0、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h分別從3個實驗箱隨機選取一尾，用含丁香酚自來水處理后立即取頭腎、肝臟、脾臟、體腎，提取總RNA，并合成第一鏈cDNA，對照組采用同樣的方法制備cDNA模板。Real-Time qPCR方法同上。

數據處理應用Bio-Rad CFX Manager軟件，采用2-ΔΔCt法計算單個樣品中ScTLR3的相對表達量，并用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），顯著性水平為*P＜0.05，**P＜0.01。

2　結果

2.1ScTLR3 基因的克隆和序列分析

ScTLR3基因全長4043 bp，GenBank No. KT 186364，其中ORF為2715 bp，編碼904個氨基酸殘基，5′-非編碼區（Untranslated region，UTR） 216 bp和3′-UTR 1112 bp，在其3′-UTR包含3個多聚腺苷酸加尾信號“aataaa”或“aacaaa”和5個mRNA不穩定信號“attta”以及典型的Poly A尾巴。預測的ScTLR3蛋白相對分子量為102.67kD，理論等電點為8.76。SMART結構顯示，ScTLR3由N-端的信號肽（SP，1—23aa）、14個LRR基序（53—72aa，99—118aa，146—173aa，170—193aa，275—297aa，298—321aa，353—376aa，430—454aa，506—529aa，530—553aa，563—585aa，586—609aa，610—633aa，635—658aa）、LRR_CT 基序（646—698aa）、TM（704—726aa）和TIR（757—900aa）組成（圖1a）。I-TASSER 3D結構模型顯示，ScTLR3包括14個α螺旋、13個β折疊，LRRs區域為馬蹄形結構（圖1b/c）。

2.2不同物種TLR3的進化分析

結果顯示，整個系統發育樹分為兩支：硬骨魚類聚為一支，兩棲類和其他參與分析的陸生動物聚為一支； 硬骨魚類中，淡水硬骨魚類和海水硬骨魚類各為一支，其中赤眼鱒和武昌魚聚為一支。進一步分析不同物種TLR3 TIR 結構域氨基酸序列，ScTLR3與草魚（ABI64155.1）和鯉（ABC86865.1）相似度高達97%，其次是團頭魴（ABI83673.1） 96%（圖2）。

圖2　應用CLUSTALW進行多序列比對并使用MEGA 6.06采用鄰接法構建TLR3的系統進化樹Fig. 2　Phylogenetic tree constructed from a CLUSTALW alignments and MEGA version 6.06 Neighbor-Joining of selected TLR3 sequences

2.3ScTLR3的組織表達及GCRV誘導表達分析

采用Real-Time qPCR方法檢測ScTLR3 mRNA在健康赤眼鱒不同組織的相對表達量及GCRV攻毒后的表達量變化，結果表明：ScTLR3 mRNA在所檢測的10個組織中均有表達，由低到高依次為：胸腺＜鰓＜體腎＜腦＜腸＜脾臟＜肌肉＜頭腎＜心臟＜肝臟，且肝臟中的相對表達量極顯著高于其他9個組織（P＜0.01）（圖3）。與對照組相比，感染GCRV后肝臟、脾臟、腎臟和頭腎組織中ScTLR3 mRNA均上調表達，其中，肝臟和脾臟中相對表達量除0和120h外均極顯著高于對照組（P＜0.01），頭腎中相對表達量除0外均極顯著高于對照組（P＜0.01）。感染GCRV后ScTLR3 mRNA在被檢測的四種組織中表達特征相似，均出現兩個表達峰，同時又具有一定差異性，肝臟和脾臟組織中第一個表達峰出現在24h，第二個表達峰出現在96h但低于前一個，腎臟組織中第一個表達峰出現在24h，但第二個表達峰并不明顯，頭腎組織中兩個表達峰出現較肝臟和脾臟早，分別出現在12h和72h且表達量相近（圖4）。

圖3　健康赤眼鱒心臟、腦、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、肌肉、腸、鰓和胸腺組織中ScTLR3相對表達量Fig. 3　Relative expression of ScTLR3 in different tissues of barbel chub，include heart，brain，liver，spleen，trunk kidney，head kidney，muscle，intestines，gills and thymus

圖4　感染GCRV后ScTLR3基因的時空表達特征Fig. 4　Expression pattern of ScTLR3 after infected by GCRV

3　討論

在免疫反應中，機體對病原的識別、呈遞與免疫反應的強度、速度直接相關，TLR3主要參與識別胞內病毒dsRNA，并以其特有的MyD88非依賴途徑激活下游免疫因子，誘導I型干擾素（α-IFN和β-IFN）表達和分泌，達到抑制病毒復制的目的［25—27］。基于前期赤眼鱒GCRV攻毒實驗中赤眼鱒死亡率顯著低于草魚的結果和TLR3在哺乳動物免疫反應中的重要作用以及其在各物種間的保守性，我們希望探究TLR3是否在赤眼鱒抗病毒免疫反應中也發揮了作用。

3.1ScTLR3 cDNA序列及結構特征分析

本實驗運用RACE方法獲得了ScTLR3基因cDNA全長序列4043 bp，預測其開放閱讀框（ORF） 2715 bp，ScTLR3基因3′-UTR 1112 bp，較草魚（DQ864497.1）、團頭魴（DQ986365.1）、斑馬魚（NM_001013269.3）等長400—600 bp，已有研究表明，3′-UTR的長度和序列構成與mRNA的穩定性、轉錄調控和蛋白定位均有一定的影響［28—30］。不穩定的mRNA 3′-UTR通常含有AU富含基序（AU-rich elements，AREs），如免疫調節和炎癥反應相關基因IL-1、IL-2、IL-4、TNF和IFN等，ARE結構中最典型的基序為ATTTA［31—33］。在本實驗中，ScTLR3基因mRNA 3′-UTR包含5個ATTTA序列，而草魚（DQ864497.1）包含4個、人（NM_003265.2）包含3個、團頭魴（DQ986365.1）包含2個、斑馬魚（NM_001013269.3）一個也沒有。結果表明，ScTLR3基因的穩定性不及草魚、人、團頭魴和斑馬魚。氨基酸序列對比分析發現，ScTLR3是一個保守型很高的基因，ScTLR3與草魚TLR3相似度高達96%，與其他鯉科魚類（團頭魴、斑馬魚、稀有鮈鯽、鯽等）相似度也達到了達82%以上，這提示ScTLR3很可能是赤眼鱒體內一種重要的基礎分子。結構域分析發現，ScTLR3主要由胞外的LRRs結構域、TM結構域和胞內的TIR結構域組成，具有TLRs的典型結構。3D模型顯示ScTLR3基因LRRs結構域為典型的馬蹄形結構，有資料證明，該結構能與dsRNA形成穩定的二聚體，有利于dsRNA的識別［34，35］。

3.2ScTLR3表達特征

不同物種TLR3 mRNA在健康個體組織中的表達情況有所差異。Su等［7］定量檢測未經GCRV攻毒的稀有鮈鯽，發現TLR3在鰓、心臟、腸、體腎、肝臟、肌肉和脾臟中均有表達，在肝臟、肌肉和體腎中表達量較高。Yang等［36］定量檢測健康鯉鰓、心臟、腸、體腎、肝臟、肌肉和脾臟中TLR3的表達量，發現鯉肌肉和心臟中TLR3表達量較低，而在腸、體腎和肝臟中表達量較高。在本實驗中，ScTLR3 mRNA在被檢測的10個組織中均有表達，在肝臟中的表達量極顯著的高于其他9個組織，這可能與組織的功能差異有關。

大量誘導表達實驗表明，魚類TLR3基因能被dsRNA病毒、dsRNA類似物poly（I∶C）或DNA病毒誘導表達［37］。Su等［8］用GCRV感染草魚后發現，草魚脾臟中TLR3的表達量在1—7d均上調表達，1—2d上升到對照組的3倍以上，除第4天略微下降外，至第7天（實驗結束）一直上升。Huang等［16］定量檢測注射poly（I：C）的大黃魚，發現其脾臟組織TLR3表達量在注射后6h顯著上升，之后逐步下降，至48h下降到初始水平； 而肝臟中在24h前上升較為緩慢，至48h迅速上升，達到最大值。Hu等［14］發現感染大菱鲆虹彩病毒（Turbot reddish body irido-virus，TRBIV）后，大菱鲆肝臟和肌肉中TLR3表達量在1d迅速上升，然后緩慢下降至第5天達到初始水平。在本實驗中，赤眼鱒在感染GCRV后赤眼鱒肝臟、脾臟和體腎中的TLR3 mRNA的表達特征相似，整體表現為先上升后下降，然后小幅上升，最后回歸初始水平，在24h出現表達量峰值。這一結果與Phelan等［9］用SHRV感染斑馬魚成魚后TLR3的表達情況相似，與Su等［8，38］用GCRV感染稀有鮈鯽后鰓中TLR3表達特征以及GCRV感染草魚后脾臟中TLR3表達特征不同。另外，赤眼鱒在感染GCRV后，頭腎中的TLR3 mRNA表達量在12h迅速上升，在72h迅速達到第二表達峰值，這一結果較草魚和稀有鮈鯽TLR3表達變化更加快速，但是否與赤眼鱒對GCRV抗性有關需要進一步研究證明。

4　結論

ScTLR3主要由富亮氨酸結構域（LRRs）、跨膜結構域（TM）和Toll/白介素-1受體結構域（TIR）組成，具有TLRs的典型結構特征，在健康赤眼鱒肝臟中特異性表達； GCRV攻毒后，ScTLR3 mRNA在赤眼鱒肝臟、脾臟、體腎和頭腎中的表達水平顯著升高，這些結果提示TLR3在赤眼鱒抵抗GCRV入侵反應中發揮了重要作用。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF TOLL-LIKE RECEPTOR 3 GENE IN BARBEL CHUB SQUALIOBARBUS CURRICULUS

XIAO Tiao-Yi1，2，LI Wei1，WANG Rong-Hua1，LIU Qiao-Lin1，2，PENG Hui-Zhen1，2and SU Jian-Ming1，3
（1. Hunan Engineering Technology Research Center of Featured Aquatic Resources Utilization，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China； 2. Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde 415000，China； 3. College of Animal Veterinary and Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

To investigate whether the toll-like receptor 3（ScTLR3） gene involve in antiviral immune response，TLR3 full-length cDNA in barbel chub（Squaliobarbus curriculus） was cloned and characterized with RACE technique and grass carp reovirus（GCRV） infection was used The method of real-time qPCR was used to examine the expression of ScTLR mRNA in 10 different tissues and the relative expression in liver，spleen，trunk kidney and，head kidney after infection at different times. The results showed that the full-length cDNA of ScTLR3 was 4043 bp including a 216 bp 5′-terminal untranslated region（UTR），an 1112 bp 3′-terminal untranslated region（UTR） and a 2715 bp open reading frame（ORF） encoding a polypeptide of 904 amino acid residues. The putative isoelectric point（pI） and molecular weight（Mw） of ScTLR3 were 8.76 and 102.67 kD，respectively. The ScTLR motifs were consisted of N-terminal signal peptide（SP），14 leucine-rich repeats（LRRs），transmembrane domain（TM），and the Toll/IL-1 Receptors domain（TIR） in C-terminal. ScTLR3 mRNA was expressed in all tested tissues，and its expression in liver was extremely significant higher than other tested tissues in health barbell chub（P＜0.01）. GCRV infection induced the ScTLR expression in liver，spleen，trunk kidney，and head kidney. Compared with the control group，the ScTLR mRNA expression levels in liver，spleen and trunk kidney tissues of barbel chub was induced 5-，7-，and 6- fold at 24h post infection，respectively. These results suggest that ScTLR3 may play an important role in the immune response of barbel chub against GCRV infection.

Squaliobarbus curriculus； Toll-like Receptor 3； Molecular cloning； Expression characterizations

Q781

A

1000-3207（2016）05-0894-08

10.7541/2016.115

2015-10-30；

2016-04-21

國家自然科學基金面上項目（31272652）； 國家自然科學基金青年項目（31402289）； 湖南農業大學科學基金項目（13YJ04）資助［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31272652，31402289）； Science Foundation of Hunan Agricultural University（13YJ04）］

肖調義（1964—），男，湖南邵陽人； 教授； 研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail：tyx1128@163.com；李偉（1989—），男，湖南常德人； 碩士研究生； 研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail：match10@qq.com

肖調義，E-mail：tyx1128@163.com