靶向血管內皮生長因子受體2超聲分子成像在小鼠原位膠質瘤血管新生和邊界識別中的應用

張海嫻，李一鳴，汪曉虹，邵 潔，王 怡

復旦大學附屬華山醫院超聲醫學科，上海 200040

靶向血管內皮生長因子受體2超聲分子成像在小鼠原位膠質瘤血管新生和邊界識別中的應用

張海嫻，李一鳴，汪曉虹，邵 潔，王 怡

復旦大學附屬華山醫院超聲醫學科，上海 200040

目的：探討攜帶抗血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）單克隆抗體的超聲微泡造影劑（microbubble，MB）在評價小鼠原位膠質瘤血管新生和邊界識別中的作用。方法：以生物素-親和素橋接法構建靶向微泡（MBv），體外鑒定其性質。建立小鼠GL261膠質瘤模型，分別注射MBv和普通微泡（MBc）進行超聲造影檢查。結果：成功構建偶聯抗小鼠VEGFR2單克隆抗體的MBv，造影結果表明MBv較MBc能更好地評價小鼠膠質瘤血管新生和腫瘤邊界。結論：MBv是良好的腫瘤靶向造影劑，應用MBv可較好地實現術中評價小鼠膠質瘤血管新生，更好地輔助術中超聲導航。

血管內皮生長因子受體2；原位膠質瘤；超聲

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統腫瘤，占全部顱內腫瘤的35.26%～60.96%［1］。隨著神經外科學微創、精確理念的不斷深入，如何最大限度地切除腫瘤同時又不損傷重要的神經功能成為當今手術醫師的難題［2-4］。研究表明，實體腫瘤在生長與轉移過程中均依賴新生血管形成，血管系統在腫瘤發生、發展過程中具有至關重要的作用［5］。由于腫瘤血管發育不成熟，內部存在缺氧微環境，從而刺激腫瘤內皮細胞處于持續高度增殖狀態，誘導一系列特異性分子表達上調，包括血管內皮生長因子受體2 （vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）［6-7］、整合素αvβ3 （αvβ3-integrin）［8］等。VEGF通過與VEGFR2結合，促進血管內皮細胞分裂、增殖，促使細胞浸潤，誘導血管新生［9-11］。

本研究利用生物素-親和素橋接方法，將抗VEGFR2抗體與生物素化的脂質微泡 （microbubble，MB）偶聯構建靶向微泡 （MBv），利用VEGFR2靶向作用將微泡主動靶向至腫瘤新生血管，通過高頻超聲成像術中實時顯示膠質瘤的血管新生，從而實現準確、便捷的術中膠質瘤切除實時導航技術。

1　資料和方法

1.1普通微泡（MBc）與MBv的制備

將一定比例的二硬脂酰磷酯酰膽堿（distearoyl phosphatidylcholine，DSPC）、二硬脂酰磷酯酰乙醇胺（distearoyl phosphoethanolamine，DSPE）-聚乙二醇2000 ［poly（ethylene glycol） 2000，PEG 2000］和生物素酰化聚乙二醇2000修飾二硬脂酰磷酯酰乙醇胺（DSPEPEG2000-Biotin）溶解于三氯甲烷中，并在渦旋混合器上混勻。使用干燥的N2流除去溶劑使其在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中干燥2 h以上。然后加入一定體積脫氣的Tris緩沖溶液（含10%甘油和10%丙二醇，pH 7.4），得到一定濃度的磷脂溶液。加熱磷脂溶液至其相轉變溫度（55～60 ℃）以上，并用水浴超聲制成磷脂溶液，分裝入2 mL西林瓶中（1 mL/瓶），將瓶中空氣置換成全氟丙烷，機械震蕩器震蕩45 s獲得生物素化的超聲微泡。另以DSPE取代DSPE-PEG2000-Biotin，按實驗室常規方法制備MBc造影劑作為對照。

1.2小鼠GL261膠質瘤模型的建立

C57小鼠，雄性，體重18～20 g，6～8周齡，由復旦大學上海醫學院動物房提供。GL261小鼠膠質瘤細胞系由復旦大學附屬華山醫院神經外科研究所提供。復蘇GL261細胞，選用DMEM培養基（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素），于37 ℃，5% CO2孵箱中培養，當細胞生長至90%融合時傳代，用胰酶消化培養的細胞，制成1×108個/mL懸液備用。小鼠取俯臥位固定于立體定位儀上，術者用75%乙醇行穿刺點消毒，以前囟為原點，向右2 mm，向前1.3 mm，垂直進針3.5 mm，注射備好的細胞懸液2 μL。

1.3微泡體外黏附實驗

將人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）在24孔板內培養過夜，將兩種微泡分別與HUVEC孵育30 min后充分洗滌，在光鏡下觀察兩種微泡的黏附。

1.4超聲造影實驗

麻醉并綁定動物，用Vevo 2100超聲儀MS-250高頻線陣探頭，先行二維超聲檢查腫瘤，選擇最大切面后轉入超聲分子成像模式。探頭發射頻率18 MHz，機械指數0.16，記錄幀頻41 Hz。行外科手術去除小鼠顱頂骨，暴露荷瘤大腦，完成一次造影后切除部分瘤體，再次進行造影。每只小鼠均經尾靜脈先后注射MBv和MBc各6×107個。兩種造影劑注射順序隨機，兩次造影之間間隔1 h。從注入造影劑即刻起全程記錄動態影像，直至造影劑廓清為止。所有聲學造影圖像自動保存，以備分析。

1.5造影圖像分析

應用儀器自帶的Vevo CQ軟件進行圖像分析，選擇Target模式，儀器自動選擇造影前及造影后的圖像進行扣除并生成偽彩。

2　結 果

2.1MBc和MBv體外黏附實驗

光鏡下觀察HUVEC周邊偶有MBc黏附，平均值為（1.5±0.3）個（圖1）；而MBv在HUVEC周邊大量黏附，平均值為（9.5±0.5）個（圖2），差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2腫瘤超聲造影情況及圖像分析

10只小鼠原位腫瘤模型均建模成功（圖3）。在分子造影模式下，可見注入MBc或MBv即刻造影劑從腫瘤周圍逐漸向中央部充填，直至整個瘤體明顯增強。與MBc造影（圖4）比較，MBv（圖5）能更好地顯示腫瘤組織的血管新生。挖除部分腫瘤后（圖6），再次注入MBc或MBv，MBv（圖7）仍較MBc（圖8）能更好地顯示腫瘤組織的血管新生。

圖1　普通微泡體外黏附HUVEC實驗結果

圖2　VEGFR2靶向微泡體外黏附HUVEC實驗結果

圖3　小鼠GL261原位膠質瘤模型二維超聲圖

圖4　腫瘤挖除前小鼠原位膠質瘤超聲分子成像（一）

圖5　腫瘤挖除前小鼠原位膠質瘤超聲分子成像（二）

圖6　腫瘤部分挖除后小鼠GL261原位膠質瘤二維超聲圖（一）

圖7　腫瘤部分挖除后小鼠原位膠質瘤超聲分子成像（二）

圖8　腫瘤部分挖除后小鼠原位膠質瘤超聲分子成像（三）

3　討 論

超聲分子影像學是應用超聲影像學方法，將靶向超聲造影劑注入體內，通過受體與配體結合特異性停留于靶組織，從而觀察靶組織在組織、細胞及亞細胞水平的成像，反映病變組織在分子基礎上的變化［12］。

實體腫瘤的生長均依賴新生血管生成，腫瘤內部的缺氧微環境致使腫瘤血管內皮細胞持續高特異性表達某些促生長受體，其中最重要之一為VEGFR2，而該受體在正常血管表達極低［5，8-9］。本研究采用生物素-親和素橋接法構建了攜帶抗VEGFR2單克隆抗體的MBv，用體外黏附實驗鑒定其性質，并結合超聲造影檢查評價活體腫瘤新生血管的情況。體外鑒定結果表明，本實驗制備的生物素化微泡對親和素具有很好的結合力。而通過生物素-親和素橋接法構建的MBv，其所偶聯的抗體在體外亦有很好的活性，可與相應二抗特異性結合。

體內實驗中，腫瘤挖除前利用超聲分子成像評價小鼠原位膠質瘤血管新生情況，顯示膠質瘤的邊界以引導膠質瘤切除，術中仍可再次進行靶向成像，不受術中水腫偽像或腦漂移的影響，可多次重復進行，良好地實現膠質瘤切除術中超聲導航。

綜上所述，本研究應用生物素-親和素橋接法構建了MBv，可與新生血管內皮細胞表面的靶分子特異性結合，并產生顯著的主動性靶向超聲分子顯像，為無創性評價組織內血管新生提供了一種新的方法，更好地實現了膠質瘤術中超聲導航。

［1］ SOLHEIM O， SELBEKK T， JAKOLA A S， et al. Ultrasound-guided operations in unselected highgrade gliomas-overall results， impact of image quality and patient selection ［J］. Acta Neurochir （Wien）， 2010，152（11）: 1873-1886.

［2］ LACROIX M， ABI-SAID D， FOURNEY D R， et al. A multivariate analysis of 416 patients with glioblastoma multiforme: prognosis， extent of resection， and survival ［J］. J Neurosurg. 2001， 95（2）: 190-198.

［3］ SANAI N， POLLEY M Y， MCDERMOTT M W， et al. An extent of resection threshold for newly diagnosed glioblastomas ［J］. J Neurosurg， 2011， 115（1）: 3-8.

［4］ MARKO N F， WEIL R J， SCHROEDER J L， et al. Extent of resection of glioblastoma revisited: personalized survival modeling facilitates more accurate survival prediction and supports a maximum-safe-resection approach to surgery ［J］. J Clin Oncol， 2014， 32（8）: 774-782.

［5］ ABOU-ELKACEM L， BACHAWAL S V， WILLMANN J K. Ultrasound molecular imaging: Moving toward clinical translation ［J］. Eur J Radiol， 2015， 84（9）: 1685-1693.

［6］ WANG H J， KANEKO O F， TIAN L， et al. Threedimensional ultrasound molecular imaging of angiogenesis in colon cancer using a clinical matrix array ultrasound transducer ［J］. Invest Radiol， 2015， 50（5）: 322-329.

［7］ STREETER J E， GESSNER R C， TSURUTA J， et al. Assessment of molecular imaging of angiogenesis with three-dimensional ultrasonography ［J］. Mol Imaging，2011， 10（6）: 460-468.

［8］ KORPANTY G， CARBON J G， GRAYBURN P A， et al. Monitoring response to anticancer therapy by targeting microbubbles to tumor vasculature ［J］. Clin Cancer Res，2007， 13（1）: 323-330.

［9］ PYSZ M A， MACHTALER S B， SEELEY E S， et al. Vascular endothelial growth factor receptor type 2-targeted contrast-enhanced US of pancreatic cancer neovasculature in a genetically engineered mouse model: potential for earlier detection ［J］. Radiology， 2015， 274（3）: 790.

［10］ WILLMANN J K， LUTZ A M， PAULMURUGAN R，et al. Dual-targeted contrast agent for US assessment of tumor angiogenesis in vivo ［J］. Radiology， 2008， 248（3）: 936-944.

［11］ WILLMANN J K， PAULMURUGAN R， CHEN K， et al. US imaging of tumor angiogenesis with microbubbles targeted to vascular endothelial growth factor receptor type 2 in mice ［J］. Radiology， 2008， 246（2）: 508-518.

［12］ DAYTON P A， RYCHAK J J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents ［J］. Front Biosci， 2007， 12: 5124-5142.

Application of vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted ultrasound molecular imaging in intraoperative assessment of tumor angiogenesis and boundary identification in vivo

ZHANG Haixian， LI Yiming，WANG Xiaohong， SHAO Jie， WANG Yi （Department of Ultrasound， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）
Correspondence to: WANG Yi E-mail: Y_wang1111@hotmail.com

Objective: To develop and validate a targeted ultrasonographic （US） imaging agent with microbubbles （MBs）that binds to vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2） in a murine model for tumor angiogenesis. Methods: Targeted US imaging agent was prepared by bridged avidin biotin through binding anti-VEGFR2 antibody to the shell of perfluorocarbonfilled MBs. The binding specificities of targeted MB （MBv） and with nonlabeled MB （MBc） were tested with VEGFR2-positive cells（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）. In vivo imaging signals of contrast-enhanced US by using anti-VEGFR2-targeted MBv and MBc were quantified in 10 mice bearing GL261 cells. Results: Attachment of HUVECs was significantly higher for MBv（mean MBs per cell 9.5±0.5） than MBc （mean MBs per cell 1.5±0.3）. The imaging signal in the murine tumor angiogenesis model was significantly higher for MBv than for MBc. Conclusion: Targeted contrast-enhanced US directed at VEGFR2 improves in vivo visualization of tumor angiogenesis and boundary identification in a murine model of orthotopic gliomas.

Vascular endothelial growth factor receptor 2； Orthotopic glioma； Ultrasound

R445.1

A

1008-617X（2016）03-0248-04

王怡 E-mail：Y_wang1111@hotmail.com

（2016-09-03）