羥氯喹對調節性T細胞體外分化的調控作用

楊驥 楊雪 楊潔 李明

200032上海，復旦大學附屬中山醫院皮膚科（楊驥、李明）；復旦大學附屬華山醫院風濕科（楊雪）；上海市血液中心（楊潔）

·研究報道·

羥氯喹對調節性T細胞體外分化的調控作用

楊驥 楊雪 楊潔 李明

200032上海，復旦大學附屬中山醫院皮膚科（楊驥、李明）；復旦大學附屬華山醫院風濕科（楊雪）；上海市血液中心（楊潔）

目的明確羥氯喹對調節性T細胞（Treg）體外分化的調控作用。方法取1例健康人外周血15 ml，分離單個核細胞（PBMC）后，分選幼稚性T細胞用于實驗，實驗分對照組和試驗組，對照組加入轉化生長因子β（TGF?β）和白細胞介素2（IL?2）協同誘導因子體外培養；試驗組加入誘導因子及20 μmol/L羥氯喹體外培養。分別在培養的第0、6、12天，通過流式細胞儀檢查CD4+Foxp3+Treg的數量和比例。結果培養第0、6和12天，對照組Treg細胞數量分別為（2±0.4）× 104、（13.2±5.2）× 104和（143.5±35.9）×104；試驗組分別為（2±0.5）×104、（2.4±0.4）×104和（5.6±3.5）×104。第6和12天，兩組CD4+Foxp3+Treg細胞數量差異均有統計學意義（t值分別為3.78、6.16，均P＜0.05）。培養第12天，試驗組CD4+Foxp3+Treg細胞比例為79.7%±18.1%，對照組為16%±13%（t=11.77，P＜0.01）。結論羥氯喹在體外具有抑制CD4+Foxp3+Treg細胞增殖和分化的作用。

羥氯喹；T淋巴細胞，調節性；細胞增殖；細胞分化

調節性T細胞（Treg）是一群具有免疫抑制作用的CD4+T細胞，具有維持體內免疫平衡的作用［1?3］。研究表明，系統性紅斑狼瘡（SLE）患者Treg數量減少，功能受損，并與狼瘡病情活動指數（SLEDAI）相關［4-6］。羥氯喹是目前臨床常用的治療SLE的基本藥物，其對Treg的調控作用并不清楚，本研究觀察羥氯喹對體外Treg分化的調控作用。

一、試劑、儀器和細胞

健康人外周血單個核細胞（來源于上海市血液中心），幼稚性CD4+T細胞分選磁珠（德國MiltenyiBiotec公司），FITC標記的CD4單克隆抗體（美國BD Pharmingen公司），PE標記的Foxp3單克隆抗體（美國eBioscience公司），羥氯喹（英國Abcam公司），抗CD3/CD28活化磁珠（Life Dynabeads），轉化生長因子β（TGF?β）和白細胞介素2（IL?2）（美國Peprotech公司），流式細胞儀（FACS?Calibur，美國BD公司），胎牛血清（美國Life Invitrogen公司），細胞培養液RPMI 1640G（美國Gibco公司）。

二、方法

1.幼稚性CD4+T淋巴細胞的分選和鑒定：取1例健康人外周血15 ml，分選外周血單個核細胞（PBMC），加入幼稚性T細胞分選磁珠分選。分選到的幼稚性CD4+T細胞經CD4?FITC單克隆抗體標記后，通過流式細胞儀鑒定，分選的純度達95%以上，分選百分率為10%～15%。本研究經倫理委員會，并簽署知情同意書。

2.CD4+Treg細胞的擴增及鑒定：對照組，第0天，將分選到的幼稚性CD4+T細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，加入抗CD3/CD28活化磁珠（5 ml/L）、TGF?β（10 μg/L）和IL?2（20 U/ml）擴增。第6、9天半量換液，補充相應的細胞因子。實驗組，在培養的第0天加入20 μmol/L羥氯喹，第6、9天半量換液，補充相應的細胞因子以及羥氯喹。對照組和實驗組每組設3復孔，每組初始放入等量分選到的幼稚性CD4+T細胞。部分細胞在培養第0天和第6天收集細胞，并通過流式細胞儀檢測CD4+Foxp3+Treg細胞。將收獲的細胞用聚丁二酸丁二醇酯（PBS）洗滌1遍，CD4?FITC常溫避光表面染色15 min，PBS洗滌后，加入固定劑固定30 min；用破膜劑洗滌2次后，加入Foxp3-PE抗體染色30 min。PBS洗滌后，流式細胞儀檢測。

3.統計學處理：對照組和實驗組CD4+Foxp3+Treg細胞分化數量比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。所有統計分析都在SPSS15.0 for windows統計軟件中進行。

三、結果

1.羥氯喹對體外CD4+Foxp3+Treg細胞分化數量的影響：體外誘導幼稚性T細胞向Treg誘導分化6 d后，CD4+Foxp3+Treg細胞數量增多，培養至12 d增多更明顯。而實驗組在培養第6天和第12天CD4+Foxp3+Treg細胞數量增加受到明顯抑制，與對照組比較，差異均有統計學意義。見表1。

2.羥氯喹對體外CD4+Foxp3+Treg細胞分化比例的影響：體外誘導幼稚性T細胞向Treg分化前CD4+Foxp3+Treg細胞比例為1.23%±0.1%，誘導12 d后對照組為79.7%±18.1%，試驗組為16.0%± 6.1%（圖1），兩組比較，t=11.77，P＜0.01。

四、討論

羥氯喹治療SLE的主要機制為減低皮膚對紫外線的敏感性，穩定溶酶體膜，抑制變性DNA與抗體結合，抑制細胞免疫和補體活性［7-8］。

我們的研究表明，體外羥氯喹不僅能時間依賴地抑制幼稚性T細胞向Treg細胞分化，減少Treg細胞擴增的數量，也抑制了Fox3+Treg細胞在CD4+T細胞中的比例，表明羥氯喹在體外對Treg的分化和增殖具有抑制作用。推測羥氯喹在治療SLE的過程中并不是通過促進Treg的分化，而可能是通過其他途徑抑制免疫炎癥。

盡管本研究提示，羥氯喹對體外Treg分化和增殖具有抑制作用，但我們研究時采用的是20 μmol/L羥氯喹，其主要依據臨床羥氯喹200 mg/d的等效劑量換算，其他劑量的羥氯喹對Treg分化的影響作用有待進一步研究并明確。此外本研究結果提示，羥氯喹抑制幼稚性T細胞向Treg分化，而羥氯喹對成熟Treg的分化和增殖的影響也有待進一步明確。

表1 羥氯喹干預體外誘導幼稚性T細胞向調節性T細胞分化后不同時間CD4+Foxp3+Treg細胞數量的變化（x± s，× 104）

圖1 羥氯喹對體外CD4+Foxp3+Treg細胞分化影響的流式細胞儀檢測圖

［1］ Campbell DJ.Control of regulatory T cell migration,function,and homeostasis［J］.J Immunol,2015,195（6）:2507 ?2513.DOI:10.4049/jimmunol.1500801.

［2］ Ohl K,Tenbrock K.Regulatory T cells in systemic lupus erythematosus［J］.Eur J Immunol,2015,45（2）:344?355.DOI:10.1002/eji.201344280.

［3］ Spence A,Klementowicz JE,Bluestone JA,et al.Targeting Treg signaling for the treatment of autoimmune diseases［J］.Curr Opin Immunol,2015,37:11?20.DOI:10.1016/j.coi.2015.09.002.

［4］ Yang J,Chu Y,Yang X,et al.Th17 and natural Treg cell population dynamics in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum,2009,60（5）:1472?1483.DOI:10.1002/art.24499.

［5］ Venigalla RK,Tretter T,Krienke S,et al.Reduced CD4+,CD25?T cell sensitivity to the suppressive function of CD4+,CD25high,CD127?/low regulatory T cells in patients with active systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum,2008,58（7）:2120 ?2130.DOI:10.1002/art.23556.

［6］ Ohl K,Tenbrock K.Regulatory T cells in systemic lupus erythe?matosus［J］.Eur J Immunol,2015,45（2）:344?355.DOI:10.1002/eji.201344280.

［7］ Olsen NJ,Schleich MA,Karp DR.Multifaceted effects of hydroxy?chloroquine in human disease［J］.Semin Arthritis Rheum,2013,43（2）:264?272.DOI:10.1016/j.semarthrit.2013.01.001.

［8］ Costedoat?Chalumeau N,Dunogué B,Morel N,et al.Hydroxy?chloroquine:a multifaceted treatment in lupus［J］.Presse Med,2014,43（6 Pt 2）:e167?180.DOI:10.1016/j.lpm.2014.03.007.

Regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells

Yang Ji,Yang Xue,Yang Jie,Li Ming
Department of Dermatology,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China（Yang J,Li M）;Department of Rheumatology,Huashan Hospital,Fudan University（Yang X）;Shanghai Blood Center,Shanghai 200051,China（Yang J）

ObjectiveTo evaluate the regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells（Treg）.MethodsFifteen milliliters of peripheral blood were obtained from a healthy human subject followed by isolation of monouclear cells and sorting of naive T cells.Then,the naive T cells were classified into two groups:control group cultured with the presence of tumor growth factor（TGF）?β and interleukin（IL）?2,experimental group cultured with the presence of 20 μmol/L hydroxychloroquine and inducing factors.The number and percentage of CD4+Foxp3+Treg cells were determined by flow cytometry at days 0,6,and 12.ResultsThe number of Treg cells at days 0,6,and 12 were（2 ± 0.4）× 104,（13.2 ± 5.2）× 104,and（143.5 ± 35.9）× 104respectively in the control group,（2± 0.5）× 104,（2.4± 0.4）×104,and（5.6±3.5）× 104respectively in the experimental group.There was a significant difference in the number of CD4+Foxp3+Treg cells between the two groups at days 6 and 12（t=3.78 and 6.16,respectively,bothP＜0.05）.At day 12,the percentage of CD4+Foxp3+Treg cells was 79.7% ±18.1%in the experimental group,compared to 16% ± 13%in the control group（t=11.77,P＜ 0.01）.ConclusionHydroxychloro?quine could inhibit the differentiation and proliferation of CD4+Foxp3+Treg cellsin vitro.

Hydroxychloroquine;T?lymphocytes,regulatory;Cell proliferation;Cell differentiation

Li Ming,Email:li.ming@zs?hospital.sh.cn

李明，Email：li.ming@zs?hospital.sh.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.014

國家自然科學基金（81472874、81401346）；上海市科委醫學類引導項目（134119a8400）；2014年上海市青年醫師培養計劃；復旦大學附屬中山醫院優秀骨干計劃（2015ZSYXGG13）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472874，81401346）,Medical Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission（134119a8400）;Shanghai Municipal Cultivation Plan for Youth Physicians in 2014;Outstanding Talent Plan of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University（2015ZSYXGG13）

2015?09?23）

（本文編輯：顏艷）