肢端型黑素瘤NRAS基因突變檢測及預后分析

曾穎 康曉靜 張祥月 靳穎 柴莉 曾明鳳 王瑩 王唯嘉

830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科（第一作者現在石河子大學醫學院研究生院，832000）

肢端型黑素瘤NRAS基因突變檢測及預后分析

曾穎 康曉靜 張祥月 靳穎 柴莉 曾明鳳 王瑩 王唯嘉

830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚性病科（第一作者現在石河子大學醫學院研究生院，832000）

目的分析肢端黑素瘤臨床及病理特點，檢測肢端型黑素瘤NRAS基因突變情況，探討NRAS基因突變與疾病預后的關系。方法收集經病理確診的55例肢端型黑素瘤患者的臨床及病理資料，提取其石蠟包埋組織及15例色素痣石蠟包埋組織DNA，采用PCR及DNA直接測序法檢測NRAS基因突變。采用Cox比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析。結果55例肢端型黑素瘤患者中，6例（10.9%）發生NRAS突變，突變位于61密碼子，以Q61R為主。NRAS基因1、2外顯子及15例色素痣組織未見上述突變。6例NRAS突變患者中，4例發生淋巴結轉移。多因素Cox回歸模型分析中，臨床分期晚（RR=2.54，95%CI：1.062～6.066）、未手術切除（RR=2.98，95%CI：1.316～ 3.525）、存在NRAS突變（RR=2.73，95%CI：0.932～ 3.257）為預后不良的獨立影響因素（均P＜0.05）。結論肢端型黑素瘤患者NRAS突變可能與淋巴結轉移相關，臨床分期、治療方法、NRAS突變與預后有關。NRAS突變可能為肢端型黑素瘤提供一個新的預后評估指標。

黑色素瘤；NRAS基因；突變；預后

研究顯示，黑素瘤的發生與基因突變密切相關，其中包括 BRAF［1?2］、KIT［3?4］、NRAS［5］等，前兩者在肢端型及黏膜型黑素瘤中研究較多，而位于RAS/RAF/MEK/ERK途徑的NRAS基因在肢端型黑素瘤中的突變研究較少。我們對肢端型黑素瘤NRAS基因突變進行檢測，并結合臨床及病理特點進行肢端型黑素瘤預后分析。

對象與方法

一、對象

選取新疆維吾爾自治區人民醫院病理科及皮膚科2004年1月至2010年12月確診為肢端型黑素瘤的石蠟包埋組織55份及色素痣石蠟包埋組織15份。

二、臨床資料

55例肢端型黑素瘤患者均無家族史。發病年齡20～95（62±11.8）歲，其中20～40歲4例，41～50歲10例，51～60歲15例，61～70歲20例，71～95歲6例。男30例（54.55%），女25例（45.45%）。漢族患者22例（40%），維吾爾族患者33例（60%）。肢端型黑素瘤原發于手部10例（拇指甲下5例，其他指甲下3例，其他部位2例），原發于足45例（足跖28例，足跟10例，拇趾甲下2例，其他部位5例）。原發部位伴有潰瘍者26例（47.27%），且潰瘍多見于足掌趾。病程5 d至22年，中位病程32（11～38）個月，其中病程＜1年者35例（63.63%），1～5年者15例（27.27%），＞5年者5例（9.1%）。15例（27.27%）發生淋巴結轉移，40例（72.73%）無淋巴結轉移。參照美國癌癥聯合會（AJCC）臨床分期，基于病理對原發病灶的評估，將初診患者分為以下3期：Ⅱ期40例（72.73%），無區域及遠處淋巴結轉移；Ⅲ期10例（18.18%），有區域淋巴結轉移；Ⅳ期5例（9.09%），有遠處轉移。55例患者中38例接受手術治療（包括局部腫瘤切除、截指/趾及擴大切除），17例因年齡等特殊情況未接受手術治療。

三、實驗方法

1.DNA提?。菏灠窠M織DNA提取按QIAamp DNA FFPE試劑盒（德國Qiagen公司）說明書進行，提取的DNA置-20℃保存備用。

2.PCR擴增：特異引物擴增NRAS基因1、2、3外顯子。引物使用DNAMAN軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。外顯子1上游引物：5′-TTTGCTTTCTCCAGTTTTCTGTT-3′；下游引物：5′-TGCTCCATTTCTGGCATCA-3′；外顯子2 上游引物：5′-GGGTTTTCATTTCCATTGATT-3′；下游引物：5′-TGGGTAAAGATGATCCGACA-3′；外顯子3 上游引物：5′-GACAAACCAGATAGGCAGAAAT-3′；下游引物：5′-TCCCCATAAAGATTCAGAACAC-3′。PCR反應體系（25 μl）：上下游引物各0.5 μl，模板DNA 4 μl，Taq PCR Master Mix 12.5 μl，dNTP 7.5 μl。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性50 s，外顯子1、2、3的退火條件分別是56℃50 s、56.8℃50 s、60℃ 50 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃總延伸5 min；溫度降至4℃終止反應。以dNTP代替模板DNA作為陰性對照。

3.電泳鑒定：為證實PCR產物中含有目的片段DNA，取PCR擴增產物5 μl，經2%瓊脂糖凝膠電泳（120 V）20 min，鑒定PCR擴增產量和特異性。

4.PCR擴增產物測序：將經電泳鑒定的PCR擴增產物25 μl送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所得結果與NCBI基因數據庫中的序列進行對比，確定突變位點。同時對15例色素痣石蠟包埋組織進行PCR擴增，并對擴增產物測序。

四、隨訪

對入選本研究的55例肢端型黑素瘤患者進行電話隨訪，生存期的計算從患者接受手術之日起至死亡或2010年12月31日末次隨訪日止，至末次隨訪日仍存活者生存時間定為刪失值。

五、統計學方法

應用SPSS22.0軟件，單因素分析采用Kaplan?Meier法，多因素分析采用Cox比例風險回歸模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、NRAS突變分析

1.目的片段鑒定：NRAS基因1、2、3外顯子PCR擴增產物長度分別為410、278、376 bp。肢端黑素瘤、色素痣組織和陰性對照PCR擴增片段鑒定電泳見圖1。

2.NRAS基因突變類型：55例肢端型黑素瘤患者中，6例NRAS基因的第3外顯子發生Q61R點突變（圖2），其編碼的谷氨酰胺均被精氨酸所取代。NRAS基因1、2外顯子及15例色素痣組織未見上述突變。

二、NRAS突變與臨床特征之間的關系

6例發生NRAS突變的患者中，4例皮損位于足跖，1例位于足跟，1例位于拇指甲下；2例放射狀生長，4例垂直性生長；4例有淋巴結轉移，2例無淋巴結轉移。15例淋巴結轉移患者中4例檢測到NRAS基因突變，40例無淋巴結轉移患者中2例檢測到NRAS突變，NRAS突變與淋巴結轉移有關（χ2=5.269，P=0.041）。不同民族、性別、年齡之間，NRAS突變差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 NRAS基因1、2、3外顯子PCR擴增片段凝膠電泳圖 M：標準參照物；1：色素痣組織；2～5：肢端型黑素瘤組織；6：陰性對照。NRAS基因1、2、3外顯子PCR擴增產物長度分別為410、278、376 bp

三、生存情況

55例患者均獲得完整隨訪記錄，中位（P25-P75）隨訪時間36（12～47）個月，隨訪期間死亡14例，中位（P25-P75）存活時間為32（11～ 38）個月。采用壽命表法計算1年、3年、5年生存率分別為79%、47%、32%，標準誤分別為0.008 4、0.010 4、0.010 8。

四、影響肢端型黑素瘤生存時間的因素分析

Kaplan?Meier法進行單因素分析，Clark分級、臨床分期、是否淋巴結轉移、治療方法、NRAS突變與預后有關（P＜0.05），年齡、性別、民族、原發灶是否有潰瘍與預后無關（表1）。將單因素分析中與預后不良有關的指標納入模型進行逐步Cox回歸模型分析，臨床分期晚［β值=0.931 3，RR值（95%可信區間）為2.54（1.062～ 6.066），P=0.026］、未手術切除［β值=0.742，RR值（95%可信區間）為2.98（1.316～3.525），P=0.017］、存在NRAS突變［β值 =0.514，RR值（95%可信區間）為2.73（0.932～3.257），P=0.038］為預后不良的獨立影響因素。

討 論

圖2 NRAS基因測序圖 2A：外顯子3上第61號密碼中A被G取代（CAA→CGA），發生Q61R突變（雜合突變谷氨酰胺→精氨酸）；2B：正?；蛐?/p>

表1 影響肢端型黑素瘤生存時間的單因素分析

遺傳易感性是黑素瘤發生的一個重要因素，可幫助闡釋黑素瘤的發病機制，并促進分子靶向治療的成熟。NRAS基因又名成神經細胞瘤鼠肉瘤癌基因，位于RAS/RAF/MEK/ERK途徑，與黑素瘤發病密切相關。該基因首次從成神經細胞瘤中分離得到，定位于1號染色體，含7個外顯子，基因全長85 kb，編碼含495個氨基酸的蛋白質。在正常細胞中，RAS以非活化狀態（GDP結合型）存在，當受到外源信號刺激，RAS發生磷酸化，構象改變而成為活化的GTP結合型，活化的GTP?RAS激活下游RAF信號轉導蛋白，直到被降解。RAS基因最常見的激活方式為編碼區內點突變。RAS位點的致瘤性點突變降低了RAS蛋白水解GTP為GDP的能力，其結果導致RAS蛋白與GTP持續性結合，引起下游通路持續性激活，使細胞產生不依賴于生長因子的惡性增殖，導致黑素瘤的發生。Greene等［6］和Rosso等［7］發現，NRAS的突變率在侵襲性黑素瘤的放射狀生長期達55.2%，而在垂直生長期達75.9%，推測NRAS突變對于了解腫瘤生長及預后判斷有一定的臨床意義，在本研究的6例突變中，放射狀生長2例，垂直性生長4例，與之前報道一致。

本研究中，肢端型黑素瘤好發于老年患者，發病年齡（62±11.8）歲，61～70歲肢端型黑素瘤患者最多，51～60歲次之，這與文獻報道年齡分布基本相似［8］。指甲下及足跖是維吾爾族及漢族患者常見發病部位。肢端型黑素瘤起病時易被患者誤認為是色素痣或是外傷后淤血，不能及時發現，故通常在數月后才被診斷，提示在臨床診療時要提高對肢端型黑素瘤的認識，必要時結合組織病理、免疫組化等手段明確診斷，盡量避免漏診、誤診，為患者爭取更多生存時間。

研究顯示，超過20%的黑素瘤患者存在NRAS基因突變［5］，且突變主要位于第61、12、13位密碼子［9?10］，其中尤以第61位密碼子突變率最高［11］。本研究55例肢端黑素瘤患者中，6例存在NRAS突變，位于第61位密碼子，均為Q61R突變，該突變位點為突變熱點［9?11］。本研究顯示，6例NRAS突變患者中，4例存在淋巴結轉移。有報道［12］顯示，黑素瘤轉移患者中NRAS突變率更高，提示NRAS突變可能與淋巴結甚至遠處轉移有關。

多因素Cox回歸模型分析顯示，臨床分期、治療方法、NRAS突變與預后有關，而單因素分析中Clark分級也與預后有關，這與本課題組前期分析一致［13］。研究［13］顯示，Ⅰ、Ⅱ期患者皮損均限于局部，未發生轉移，理論上可通過局部手術徹底清除腫瘤細胞，而Ⅲ、Ⅳ期患者已發生淋巴結或遠處轉移，治愈可能性較小，兩者的預后及治療方法有較大的區別。本研究顯示，臨床分期越晚，預后相對越差，且行病灶切除者預后稍好于未切除者?；颊弑M早手術切除病灶，可能延長生存時間。存在淋巴結及遠處轉移者臨床分期通常較晚，而NRAS突變可能與淋巴結甚至遠處轉移相關［13］。本研究提示，NRAS突變與預后相關，突變者預后相對較差，NRAS突變可能為臨床診斷提供一個依據，同時也可能成為一個新的預后評估指標。

［1］Long GV,Menzies AM,Nagrial AM,et al.Prognostic and clinico?pathologic associations ofoncogenic BRAF in metastatic melanoma［J］.J Clin Oncol,2011,29（10）:1239 ?1246.DOI:10.1200/JCO.2010.32.4327.

［2］郭芳,康曉靜,唐小輝,等.新疆80例惡性黑素瘤BRAF基因突變分析［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（1）:33?36.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2013.01.013.Guo F,Kang XJ,Tang XH,et al.Analysis of BRAF gene mutations in 80 patients with malignant melanoma in Xinjiang Uygur Autonomous Region［J］.Chin J Dermatol,2013,46（1）:33?36.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2013.01.013.

［3］Curtin JA,Busam K,Pinkel D,et al.Somatic activation of KIT in distinct subtypes of melanoma［J］.J Clin Oncol,2006,24（26）:4340?4346.DOI:10.1200/JCO.2006.06.2984.

［4］ Kang XJ,Shi XH,Chen WJ,et al.Analysis of KIT mutations and c?KIT expression in Chinese Uyghur and Han patients with mela?noma［J］.Clin Exp Dermatol,2016,41（1）:81?87.DOI:10.1111/ced.12659.

［5］ Flaherty KT,Hodi FS,Bastian BC.Mutation?driven drug develop?ment in melanoma［J］.Curr Opin Oncol,2010,22（3）:178?183.

［6］Greene VR,Johnson MM,Grimm EA,et al.Frequencies of NRAS and BRAF mutations increase from the radial to the vertical growth phase in cutaneous melanoma［J］.J Invest Dermatol,2009,129（6）:1483?1488.DOI:10.1038/jid.2008.374.

［7］Rosso R,Romagosa Y,Kirsner RS.Progression of NRAS and BRAF mutations in cutaneous melanoma［J］.J Invest Dermatol,2009,129（6）:1318.DOI:10.1038/jid.2009.107.

［8］孫東杰,高天文,李春英,等.肢端惡性黑素瘤100例臨床和病理分析［J］.中華皮膚科雜志,2003,36（10）:556?558.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2003.10.003.Sun DJ,Gao TW,Li CY,et al.Acral malignant melanoma:clinical?pathological features of 100 cases［J］.Chin J Dermatol,2003,36（10）:556?558.DOI:10.3760/j.issn.0412?4030.2003.10.003.

［9］ Dahl C,Guldberg P.The genome and epigenome of malignant melanoma［J］.APMIS,2007,115（10）:1161?1176.DOI:10.1111/j.1600?0463.2007.apm_855.xml.x.

［10］Bloethner S,Scherer D,Drechsel M,et al.Malignant melanoma??a genetic overview［J］.Actas Dermosifiliogr,2009,100（Suppl 1）:38?51.

［11］Jovanovic B,Egyhazi S,Eskandarpour M,et al.Coexisting NRAS and BRAF mutations in primary familial melanomas with specific CDKN2A germline alterations［J］.J Invest Dermatol,2010,130（2）:618?620.DOI:10.1038/jid.2009.287.

［12］Massi D,Simi L,Sensi E,et al.Immunohistochemistry is highly sensitive and specific for the detection of NRASQ61R mutation in melanoma［J］.Mod Pathol,2015,28（4）:487?497.DOI:10.1038/modpathol.2014.137.

［13］陳文靜,康曉靜,孫振柱,等.新疆地區96例維族惡性黑素瘤臨床特征及預后分析［J］.中國麻風皮膚病雜志,2015,31（5）:259?261,264.Chen WJ,Kang XJ,Sun ZZ,et al.Clinical and prognostic analysis of 96 patients with malignant melanoma in Xinjiang Region［J］.Chin J Lepr Skin Dis,2015,31（5）:259?261,264.

Analysis of NRAS gene mutations and prognostic factors in patients with acral melanoma

Zeng Ying,Kang Xiaojing,Zhang Xiangyue,Jin Ying,Chai Li,Zeng Mingfeng,Wang Ying,Wang Weijia
Department of Dermatology and Venereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China（the current affiliation of the first author wasGraduate School,College of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832002,Xinjiang,China）

ObjectiveTo detect NRAS gene mutations in patients with acral melanoma,and to analyze their relationship with the prognosis of acral melanoma.MethodsClinical and pathological data were collected from 55 patients with pathologically diagnosed acral melanoma.DNA was extracted from paraffin?embedded specimens from lesions of the 55 patients and 15 patients with nevus.PCR and direct DNA sequencing were performed to detect NRAS gene mutations.Univariate and multivariate analyses were performed using the Cox′s proportional hazards regression model.ResultsOf the 55 patients,6（10.9%）carried the Q61R mutation in codon 61 of the NRAS gene.No mutations were found in exon 1 or 2 of the NRAS gene in any of these paraffin?embedded specimens,and none of the pigmented nevus specimens harbored NRAS gene mutations.Of the 6 patients carrying NRAS gene mutations,4 had lymph node metastasis.Multivariate Cox regression analysis showed that independent factors of poor prognosis included advanced clinical stage（RR=2.54,95%CI:1.062-6.066,P＜ 0.05）,not receiving surgical resection（RR=2.98,95%CI:1.316-3.525,P＜ 0.05）,and carrying NRAS gene mutations（RR=2.73,95%CI:0.932-3.257,P＜ 0.05）.Conclusions NRAS gene mutations may be associated with lymph node metastasis in patients with acral melanoma.The prognosis of acral melanoma may be associated with clinical staging,treatment strategies and NRAS gene mutations.Additionally,NRAS gene mutations may serve as a new index for predicting prognosis of acral melanoma.

Melanoma;NRAS gene;Mutation;Prognosis

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

康曉靜，Email：drkangxj666@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.006

新疆維吾爾自治區國際科技合作計劃（20146022）

Fund program:International Science and Technology Cooperation Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region（20146022）

2015?09?30）

（本文編輯：周良佳 顏艷）