IL2RA-RBM17基因區域單核苷酸多態性與中國蒙古族白癜風關聯研究

烏日娜 韓建文 劉佳 布和其其格 格日勒 白云花

010050呼和浩特，內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科（烏日娜、韓建文、劉佳、布和其其格）；呼倫貝爾市人民醫院皮膚科（白云花）；錫林郭勒盟蒙醫醫院皮膚科（格日勒）

·論著·

IL2RA-RBM17基因區域單核苷酸多態性與中國蒙古族白癜風關聯研究

烏日娜 韓建文 劉佳 布和其其格 格日勒 白云花

010050呼和浩特，內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科（烏日娜、韓建文、劉佳、布和其其格）；呼倫貝爾市人民醫院皮膚科（白云花）；錫林郭勒盟蒙醫醫院皮膚科（格日勒）

目的 探討IL2RA-RBM17基因區域單核苷酸多態性與中國蒙古族白癜風的遺傳關聯性。方法收集白癜風患者425例，健康對照503例。用AxyPrep（AP-MX-BL-GDNA-25）基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組 DNA。選擇位于 IL2RA-RBM17基因區域的 9個單核苷酸多態性（rs706779、rs3134883、rs7090530、rs12251307、rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083）， 用 連 接 酶 鏈 反 應 進 行 基 因 分 型 。 用PLINK1.07及SPSS11.0進行統計分析，χ2檢驗比較白癜風組及健康對照組等位基因頻率及基因型頻率。對5個差異有統計學意義的SNP間進行連鎖不平衡檢驗，計算兩兩間的r2和D′值。用5個具有相關性的SNP構建單倍型，分析每個單倍型頻率在白癜風組和健康對照組中的分布。結果 5個SNP（rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083）的等位基因頻率與健康對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。5個SNP在顯性遺傳模式下，白癜風組中的基因型頻率均顯著低于健康對照組（P＜0.005 6）。5個差異有統計學意義的SNP間存在中等至強的連鎖不平衡（D′=0.424～1，r2=0.137～0.985）。用5個具有相關性的SNP構建單倍型，分析每個單倍型頻率的分布，發現1個單倍型（H2：CGCTA）在白癜風組頻率明顯低于健康對照組，并達到Bonferroni校正水平（P=0.001 6，OR=0.674）。結論 IL2RA-RBM17區域基因多態性與蒙古族白癜風具有相關性。

白癜風；多態性，單核苷酸；蒙古；遺傳關聯研究；基因，IL2RA-RBM17；中國

白癜風是一種色素脫失性皮膚病，是皮膚和毛發內的黑素細胞選擇性毀損所致。全球白癜風發病率為0.2%～1%［1］，其中中國漢族的發病率為0.1%～1%［2］，在不同種族和地域之間存在顯著的差異。近年遺傳關聯研究發現，一大批白癜風相關的易感基因中IL2RA-RBM17基因在歐洲及中國漢族人群的研究中均有報道［3-4］。為研究IL2RA-RBM17基因區域多態性與中國蒙古族人群白癜風相關性，本研究選擇位于IL2RA-RBM17基因區域的9個單核苷酸多態性（SNP），用連接酶鏈反應（LDR）對其進行基因分型，探討與蒙古族白癜風的相關性。

對象與方法

一、對象

1.收集內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科蒙古族白癜風患者425例，年齡（34.98±15.37）歲，發病年齡（25.60±14.23）歲；男 ∶女為 1.20∶1；蒙古族健康對照 503例，年齡（34.20±11.64）歲；男 ∶女為1.19∶1。經知情同意并簽字后抽取外周靜脈5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，置于-80℃冰箱保存備用。所有患者經臨床及病理證實。所有患者均為散發性白癜風，白斑數量大于3處，面積占體表面積8%～20%。健康對照組排除白癜風及其他自身免疫疾病，排除白癜風家族史。本研究通過內蒙古醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有入選者均簽署知情同意書。

2.SNP選擇：根據文獻報道［3-4］，在IL2RARBM17基因區域選擇9個亞洲及漢族人白癜風相關 SNP， 包 括 rs706779、rs3134883、rs7090530、rs12251307、rs4750005、rs3920615、rs4747887、rs4750012、rs7099083。

二、方法

1.基因組DNA提取：利用基因組DNA提取試劑盒（AxyPrep，APMX-BL-GDNA-25，蘇州）提取患者及健康對照組DNA，用分光光度儀檢測吸光度260 nm和280 nm，計算DNA濃度。并利用凝膠電泳檢測DNA質量，所有DNA樣本均合格。

2.引物及探針的合成：用Primer 3 online（Version 0.4.0）軟件和 Oligo（Version 6.31）軟件設計特異性引物和LDR探針，針對每個SNP位點設計一對引物，盡量保證所有SNP位點的引物的T值相同，PCR引物序列見表1。根據LDR探針設計原則設計LDR的上下游探針［5-6］，上游探針5′端用磷酸化修，LDR探針序列見表2。PCR引物及LDR探針由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

3.多重 PCR：PCR 反應體系：1 μl模板，2 μl緩沖液，0.6 μl Mg2+，2 μl dNTP，0.2 μl TaqDNA 聚合酶，2 μl引物混合液，加水補足。PCR反應條件：95℃預變性2 min；94℃ 30 s。56℃退火1.5 min。65℃30 s，35個循環。最后65℃延伸10 min。

4.多重 LDR：LDR 反應體系：1 μl緩沖液，1 μl探針混合液，0.05 μl Taq DNA 連接酶，4 μl PCR 產物，加水補足 10 μl。探針混合液濃度為 2 pmol/μl。LDR反應條件：95℃2 min預變性，94℃15 s，50℃25 s，進行40個循環。

5.測序與基因分型：反應產物經過ABI3730測序儀測序分析，最后用Genemapper軟件進行數據分析，判讀各位點上各樣本的基因分型（測序工作由上海翼和科技公司完成）。

表1 PCR引物序列

6.統計分析：所有SNP分型數據質控、等位基因及基因型頻率比較利用PLINK 1.07軟件（http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/）［7］。 計 算 9 個SNP的等位基因頻率，白癜風組及健康對照組分別進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。χ2檢驗比較白癜風組及健康對照組等位基因頻率及基因型頻率，并計算等位基因的相對危險度比值比OR及其95%可信區間（95%CI）。對9個SNP間進行連鎖不平衡檢驗，計算兩兩間的r2和D′值。單倍型分析利用Haploview軟件完成。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，根據Bonferroni多重檢驗校正原理，P＜0.0056（0.05/9）為差異有統計學意義。

表2 連接酶鏈反應探針序列

結 果

1.樣本及SNP質控白癜風及健康對照樣本在性別及年齡之間差異無統計學意義（P＞0.05）。9個SNP在白癜風及健康對照中均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）。

2.等位基因頻率比較5個SNP的等位基因頻率與健康對照組間差異有統計學意義（P＜0.05），但rs3920615、rs4747887、rs4750012 和 rs7099083 未達到Bonferroni校正水平（表3）。差異最為顯著的是rs3920615，其的等位基因C在白癜風組的頻率（0.250 0）明顯低于健康對照組中頻率（0.311 8）（P=0.003 4，OR=0.74）。經過連鎖不平衡分析，計算兩兩間的D′和r2，發現這5個等位基因頻率有差異的SNP間存在中等至強的連鎖不平衡（D′=0.42～1，r2=0.14～ 0.99）。

3.基因型分析：分別在顯性模式和隱性模式下對5個SNP進行分析，結果發現，在顯性遺傳模式下，白癜風組中的基因型頻率均顯著低于健康對照組（P＜0.005 6，表4），而在隱性模式下基因型分布無差異（P＞0.05）。

4.單倍型分析：利用5個具有相關性的SNP構建單倍型，分析每個單倍型頻率在白癜風組和健康對照組中的分布（表5），發現1個單倍型（H2:CGCTA）在白癜風組頻率（0.146）明顯低于健康對照組（0.203），并達到 Bonferroni校正水平（P=0.001 6，OR=0.67）。

表3 白癜風組和健康對照組中9個單核苷酸多態性等位基因頻率分布

表4 5個單核苷酸多態性基因型在白癜風組和健康對照組中分布及分析

表5 單倍型分析結果

討 論

白癜風皮損可以發生于身體任何部位，可沿神經皮節呈帶狀分布或泛發全身。白癜風的皮損初期多為錢幣大小，或點狀色素減退斑，圓形或不規則形，境界較明顯。白斑可局限于一個部位不變或逐漸自行消失，亦可逐漸擴大、增多，相鄰白斑互相融合形成大片白斑，可泛發全身。白斑處除色素脫失外，沒有萎縮或脫屑［2］。白癜風的皮損嚴重影響患者美觀，給患者帶來較大的心理負擔和精神壓力。白癜風的發病機制至今尚未明確，可能包括自身免疫學說、遺傳學說、神經化學因子學說、黑素細胞自身破壞學說及角質形成細胞學說等，但任何一種學說都不能完全解釋白癜風的發病機制［8］。隨著認識的深入，越來越多的學者認同多個遺傳變異位點累積效應與環境因素共同作用導致黑素細胞的自身免疫性損傷是其發病的主要假說［8］。同時，研究證實白癜風是一種與自身免疫相關的疾病，臨床可見白癜風患者及其親屬常伴發各種自身免疫疾病，同時自身免疫疾病的患者發生白癜風的概率也比正常人高［9］。研究發現，白癜風患者中存在著體液免疫細胞免疫功能的異常［10］。有學者嘗試利用CD20單克隆抗體治療泛發性活動期白癜風，部分患者皮損得到改善［11］。

2010 年，Jin 等［3］在歐洲人群中進行了一項大樣本量白癜風全基因組關聯研究，并在另外獨立人群驗證，報道了IL2RA-RBM17區域SNP與尋常型白癜風易感性相關，2013年，Tang 等［4］再次驗證 IL2RA、RBM17 與漢族人白癜風易感性的相關性。在本研究中，5個SNP的等位基因頻率在蒙古族白癜風和蒙古族健康對照間存在差異，并在顯性模式下達到Bonferroni校正水平（P＜0.005 6）。證實該區域的基因多態性與白癜風具有關聯性。單倍型分析結果發現1個保護性單倍型（H2：CGCTA）與白癜風易感性相關（P=0.001 6，OR=0.67），更加證實了該區域與蒙古族白癜風相關性，存在不同人種白癜風的共同易感基因。

本研究通過對IL2RA-RBM17基因區域9個SNP進行分型研究，證實了其與中國蒙古族白癜風的相關性，更進一步提示IL2RA-RBM17基因在白癜風發病機制中發揮著重要的作用。但是本區域覆蓋范圍較大，約80 kb。具體的易感基因需要進一步精細定位。該區域有2個已知的基因：IL2RA和RBM17。究其基因功能，IL-2及其受體在調節T細胞活化過程中起重要作用。IL2基因變異小鼠表現為調節T細胞改變，有自身免疫異常傾向。

總之，本研究以蒙古族白癜風為研究對象，對IL2RA-RBM17區域的SNP分型研究，發現IL2RARBM17區域基因多態性與蒙古族白癜風具有相關性。但本研究尚有一些不足之處：由于樣本量有限，對于陰性結果的SNP與蒙古族白癜風的相關性不能完全除外。本研究基于單個基因的多態性進行關聯分析，基因-基因間復雜交互作用未能明確，而龐大的基因網絡中相互作用非常廣泛和復雜，遺傳變異與疾病易感性的相關性是否會受到其他基因的影響尚不能確定。這9個SNP并非影響基因功能和表達的功能變異，IL2RA-RBM17基因區域的白癜風易感基因仍未能明確，需進一步研究。

［1］Spritz RA.Recent progress in the genetics of generalized vitiligo［J］.J Genet Genomics,2011,38（7）:271-278.DOI:10.1016/j.jgg.2011.05.005.

［2］Lu T,Gao T,Wang A,et al.Vitiligo prevalence study in Shaanxi Province,China［J］.Int J Dermatol,2007,46 （1）:47-51.DOI:10.1111/j.1365-4632.2006.02848.x.

［3］Jin Y,Birlea SA,Fain PR,et al.Variant of TYR and autoimmunity susceptibility loci in generalized vitiligo［J］.N Engl J Med,2010,362（18）:1686-1697.DOI:10.1056/NEJMoa0908547.

［4］Tang XF,Zhang Z,Hu DY,et al.Association analyses identify three susceptibility Loci for vitiligo in the Chinese Han population［J］.J Invest Dermatol,2013,133（2）:403-410.DOI:10.1038/jid.2012.320.

［5］Thomas G,Sinville R,Sutton S,et al.Capillary and microelectrophoretic separations of ligase detection reaction products produced from low-abundant point mutations in genomic DNA［J］.Electrophoresis,2004,25（10-11）:1668-1677.DOI:10.1002/elps.200405886.

［6］Yi P,Chen Z,Yu L,et al.Development of a PCR/LDR/capillary electrophoresis assay with potential for the detection of a betathalassemia fetal mutation in maternal plasma ［J］.J Matern Fetal NeonatalMed,2010,23 （8）:920-927.DOI:10.3109/14767050903387060.

［7］Purcell S,Neale B,Todd-Brown K,et al.PLINK:a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses［J］.Am J Hum Genet,2007,81 （3）:559-575.DOI:10.1086/519795.

［8］Quan C,Ren YQ,Xiang LH,et al.Genome-wide association study for vitiligo identifies susceptibility loci at 6q27 and the MHC［J］.Nat Genet,2010,42（7）:614-618.DOI:10.1038/ng.603.

［9］Cho SB,Kim JH,Cho S,et al.Vitiligo in children and adolescents:association with thyroid dysfunction ［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol, 2011, 25 （1）: 64-67. DOI: 10.1111/j.1468-3083.2010.03694.x.

［10］Bowcock AM,Fernandez-Vina M.Targeting skin:vitiligo and autoimmunity［J］.J Invest Dermatol,2012,132（1）:13-15.DOI:10.1038/jid.2011.353.

［11］Ruiz-Argüelles A,García-Carrasco M,Jimenez-Brito G,et al.Treatment of vitiligo with a chimeric monoclonal antibody to CD20:a pilot study［J］.Clin Exp Immunol,2013,174（2）:229-236.DOI:10.1111/cei.12168.

Association of single nucleotide polymorphisms in the IL2RA-RBM17 region with vitiligo in the Chinese Mongolian population

Wurina,Han Jianwen,Liu Jia,Buheqiqige,Gerile,Bai Yunhua

Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010050,China（WRN,Han JW,Liu J,BHQQG）;Department of Dermatology,Hulunbeier People′s Hospital,Hulunbeier 021000,Inner Mongolia,China（BaiYH）;DepartmentofDermatology,XilinGolLeagueMongolianHospital,Xilinhot026000,InnerMongolia,China（GRL）

Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms （SNPs）in the IL2RA-RBM17 region and vitiligo in the Chinese Mongolian population.Methods Five milliliters of venous blood samples were collected from 425 patients with vitiligo（patient group）and 503 healthy human controls（control group）of Mongolian nationality after informed consent,and genomic DNA was extracted with the AxyPrep DNA extraction kit（APMX-BL-GDNA-25）.Nine SNPs were selected across the IL2RA-RBM17 region,including rs706779,rs3134883,rs7090530,rs12251307,rs4750005,rs3920615,rs4747887,rs4750012 and rs7099083.Ligase detection reaction（LDR）was performed for SNP genotyping.With the PLINK 1.07 and SPSS 11.0 packages,statistical analysis was carried out by the chi-square test for comparisons of allele and genotype frequencies between the patient group and control group.Linkage disequilibrium analysis was performed for 5 SNPs by calculating ther2andD′values.Haplotype analysis of 5 related SNPs was conducted to investigate differences in haplotype frequencies between the patient group and control group.Results There were significant differences in allele frequencies of 5 SNPs,including rs4750005,rs3920615,rs4747887,rs4750012 and rs7099083,between the patient group and control group （allP＜0.05）.Under a dominant mode of inheritance,a significant decrease was observed in the frequencies of GG/GC genotypes of rs3920615,CT/CC genotypes of rs4747887,CT/CC genotypes of rs4750005,TC/TT genotypes of rs4750012 and AG/AA genotypes of rs7099083 in the patient group compared with the control group （allP ＜ 0.005 6）.Moderate to strong linkage disequilibrium was observed between the 5 SNPs （D′=0.424-1,r2=0.137-0.985）.Haplotype analysis showed that the frequency of a haplotype（H2:CGCTA）was significantly lower in the patient group than in the control group,and the difference reached statistical significance after Bonferroni adjustment（P=0.001 6,OR=0.674）.Conclusion SNPs in the IL2RA-RBM17 region are associated with vitiligo in the Chinese Mongolian population.

Vitiligo;Polymorphism,single nucleotide;Mongolia;Genetic association studies;Genes,IL2RARBM17;China

Wu Rina,Email:wurinawu506@hotmail.com

烏日娜，Email：wurinawu506@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.010

國家自然科學基金（81160189）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81160189）

2016-01-05）

（本文編輯：吳曉初）