丁酸鹽二甲雙胍對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的抗腫瘤活性及細(xì)胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荊州市第三人民醫(yī)院，湖北荊州434000）

丁酸鹽二甲雙胍對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的抗腫瘤活性及細(xì)胞毒性作用研究

王文蓉

（湖北省荊州市第三人民醫(yī)院，湖北荊州434000）

目的探討丁酸鹽二甲雙胍對(duì)乳腺癌干細(xì)胞抗腫瘤活性及細(xì)胞毒性作用。方法利用超低粘附懸浮培養(yǎng)法，從MDA-MB-231細(xì)胞中，獲得乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。隨機(jī)將其分為對(duì)照組（化療藥物）和觀察組（丁酸鹽二甲雙胍聯(lián)合化療藥物），在缺氧狀態(tài)下分別處理細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀，檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況，利用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞增殖活性。結(jié)果對(duì)照組丁酸鹽二甲雙胍能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，對(duì)ER陽(yáng)性的MCF-7無(wú)明顯影響；觀察組丁酸鹽二甲雙胍能夠明顯增加乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。結(jié)論丁酸鹽二甲雙胍可促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

丁酸鹽二甲雙胍；乳腺癌干細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

乳腺癌為女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，隨著人口年齡趨于老年化、飲食結(jié)構(gòu)多樣化，發(fā)病率呈逐年增高、年輕化趨勢(shì)［1-2］。三陰性乳腺癌［雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）均陰性］具有較高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率、死亡率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命［3］。研究證實(shí)［4］，內(nèi)分泌激素干預(yù)治療能夠明顯防治乳腺癌，其中最常見(jiàn)的是特異性雌激素受體、芳香化酶類(lèi)抑制劑類(lèi)藥物治療。二甲雙胍作為臨床常用降糖藥物，在降糖的同時(shí)還能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，因此其可作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床［5-6］。本研究中，利用超低粘附懸浮培養(yǎng)法，從MDAMB-231細(xì)胞中獲得乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，探討丁酸鹽二甲雙胍對(duì)乳腺癌干細(xì)胞抗腫瘤活性及細(xì)胞毒性的增強(qiáng)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

儀器及試藥：細(xì)胞凋亡試劑盒（上海七海復(fù)泰生物有限公司）；細(xì)胞增殖試劑盒（美國(guó)Promega公司）；流式細(xì)胞儀BD FACSCantoll（美國(guó)BD公司）。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰島素、化療藥物多柔比星（Doxorubicin）均購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；丁酸鹽二甲雙胍緩釋片（青島黃海制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040154，規(guī)格為每片0.5 g）。

細(xì)胞系：乳腺癌三陰性MDA-MB-231細(xì)胞及MCF-7（ER陽(yáng)性）細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，在含有10%胎牛血清的DMEM，RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2方法

乳腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)：MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔超低粘附培養(yǎng)板，每孔約5 000個(gè)，再進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增處理。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡：將乳腺癌干細(xì)胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿，每個(gè)皿約2×105個(gè)，常氧（21%O2）條件下，孵育48 h，嚴(yán)格按照Annexin V/PI雙染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行熒光染色處理，隨后根據(jù)流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙變量分析。

四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞增殖：將乳腺癌干細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約1×104個(gè)，于常氧狀態(tài)下孵育過(guò)夜，次日分別進(jìn)行對(duì)照組（0.2 μmol/L阿霉素）和觀察組（5 mmol/L丁酸鹽二甲雙胍+0.2 μmol/L阿霉素）各處理組的細(xì)胞處理，各組16孔，再將培養(yǎng)板治愈缺氧條件下（1%O2），孵育11 d，嚴(yán)格按照細(xì)胞增殖試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行乳腺癌干細(xì)胞細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間以方差分析處理，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1乳腺癌干細(xì)胞成功培養(yǎng)

從乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，利用超低粘附培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)出乳腺癌干細(xì)胞，體外培養(yǎng)6 d左右，形成乳腺腫瘤球，見(jiàn)圖1。

2.2丁酸鹽二甲雙胍對(duì)乳腺癌干細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)MDA-MB-321及MCF-7細(xì)胞在缺氧條件下處理48 h后凋亡情況，結(jié)果丁酸鹽二甲雙胍明顯促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞凋亡，而丁酸鹽二甲雙胍對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡作用影響不大，見(jiàn)圖2。

2.3丁酸鹽二甲雙胍增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞經(jīng)兩組處理11 d后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察組丁酸鹽二甲雙胍能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖（38.2%比83.4%），表明丁酸鹽二甲雙胍能夠增強(qiáng)MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

圖1　超低粘附培養(yǎng)法乳腺癌干細(xì)胞

圖2　Annexin V/PI雙染色法乳腺癌干細(xì)胞凋亡情況

3　討論

乳腺癌作為女性常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是女性病死率最高的腫瘤類(lèi)型。有報(bào)道稱(chēng)，乳腺癌死亡人數(shù)占女性惡性腫瘤死亡數(shù)的14%［7］。乳腺癌細(xì)胞在早期腫瘤細(xì)胞就可進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，并經(jīng)血行淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處；化療藥物治療能夠殺滅腫瘤病灶，降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，為手術(shù)治療創(chuàng)造良好機(jī)會(huì)［8-9］。近年來(lái)，乳腺癌治療手段得到不斷改進(jìn)，新型治療藥物及治療方法也不斷更新，但乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及進(jìn)展仍無(wú)法得到有效控制。過(guò)去10余年，分子靶向治療成為某些腫瘤的一線(xiàn)治療方案，雖然治療初期能夠有效控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是多數(shù)進(jìn)展性腫瘤患者不可避免地產(chǎn)生化療、放療及靶向治療的抗性，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)［10］。

乳腺癌干細(xì)胞不僅具有癌細(xì)胞的特征，還具有自我更新、多向分化、增生前潛能等普通干細(xì)胞特性。正常干細(xì)胞的自我更新、分化和增殖受調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)格控制，維持體內(nèi)各組織、器官的穩(wěn)定性。而腫瘤干細(xì)胞具有惡性增殖能力，經(jīng)過(guò)不同形式的自我更新式分裂，產(chǎn)生并擴(kuò)增具有不同分化表型、獨(dú)特形態(tài)的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞（包括腫瘤干細(xì)胞）。此外，腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)的三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用水解ATP能量，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式將多種分子從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而賦予腫瘤干細(xì)胞抵抗藥物殺傷的能力［11］。乳腺癌干細(xì)胞是腫瘤耐藥性及腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)的根源，因此，乳腺癌治療的理想效果應(yīng)以根治乳腺癌干細(xì)胞為主［12］。傳統(tǒng)放化療不易殺死乳腺癌干細(xì)胞，而使其殘存下來(lái)，易引起腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，故徹底治愈乳腺癌的關(guān)鍵在于靶向消除、殺滅乳腺癌干細(xì)胞。

二甲雙胍作為臨床治療2型糖尿病的常規(guī)藥物，通過(guò)選擇性作用于肝臟，提高肝臟對(duì)胰島素的敏感性，抑制葡萄糖的產(chǎn)生，增加肝外組織對(duì)葡萄糖的攝取［13］。有研究證實(shí)，二甲雙胍還具有降低腫瘤危險(xiǎn)，減少腫瘤患者死亡率的作用［14-15］。

目前，而乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性高、敏感性差是三陰性乳腺癌的治療效果較差的主要原因［16］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組中，丁酸鹽二甲雙胍能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，明顯增加乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。可見(jiàn)，丁酸鹽二甲雙胍能夠促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，從而增強(qiáng)化療藥物治療乳腺癌的療效。

綜上所述，乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究開(kāi)辟了新的方向，隨著乳腺癌干細(xì)胞致病機(jī)制、生物學(xué)特征、基因調(diào)控機(jī)制等研究的不斷深入，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，以及關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)的研究也日趨闡明，靶向乳腺癌干細(xì)胞治療方法也得到了進(jìn)一步的推進(jìn)，為徹底解決乳腺癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)提供了新的空間。丁酸鹽二甲雙胍充分利用了乳腺癌干細(xì)胞的特性，可增強(qiáng)乳腺癌患者對(duì)化療藥物的敏感性，提高放化療治療的臨床療效，值得臨床推廣。

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The Enhancement of Anti-Tumor Activity and Cytotoxicity on Breast Cancer Stem Cells by M etformin Hydrochloride

Wang Wenrong
（Jingzhou Third People′s Hospital，Jingzhou，Hubei，China434000）

ObjectiveTo study the enhancement of anti-tumor activity and cytotoxicity of metformin hydrochloride on breast cancer stem cells.M ethodsThe breast cancer stem cells were obtained by ultra-low adherence suspension culture from MDA-MB-231 cells.The breast cancer stem cells were randomized into the control group（doxorubicin）and the observation group（metformin hydrochloride combined with doxorubicin）.The cells were controlled under hypoxia.The cell apoptosis in two groups was detected by flow cytometry.The proliferation of breast cancer stem cells was assayed by MTT measurement.ResultsIn the control group，the treatment of metformin hydrochloride could promote the cell apoptosis of MDA-MB-231 without obvious effect on ER-positive MCF-7；in the observation group，the treatment of metformin hydrochloride could significantly increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.ConclusionMetformin hydrochloride can promote the apoptosis of breast cancer stem cells and increase the sensitivity of breast cancer stem cells to chemotherapy drug.

metformin hydrochloride；breast cancer stem cells；cell apoptosis；cell proliferation

R965；R977.1+5；R737.0

A

1006-4931（2016）17-0035-03

王文蓉（1979-），女，大學(xué)本科，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)閶D產(chǎn)科，（電子信箱）wangwenrong123ww@ sina.com。

（2016-04-25；

2016-05-13）