超聲波一步提取淡水魚氯霉素藥殘檢測的方法初探

摘 要：嘗試前處理采用超聲波一步提取淡水魚氯霉素藥物殘留并液相串聯質譜儀檢測的方法，相比于GB/T 20756-2006《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》前處理步驟相對簡單、快速，采用內標法定量，選用鰱魚為空白，添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg，回收率在 90%～120%，在0.1～2.0 ng/mL范圍內線性關系良好，R2>0.999，相對標準偏差（RSD）<9%，滿足GB/T 20756-2006和GB/T 27404-2008對準確度和精密度的要求。通過計算得到理論方法檢出限（LOD）為0002 μg/kg，理論方法定量限（LOQ）為0.008 μg/kg。

關鍵詞：超聲波；氯霉素檢測；初探

氯霉素是一種廣譜抗生素，因其效高價廉，曾在水產養殖中廣范應用。但氯霉素具有較強的毒副作用，帶來了水產品種氯霉素殘留的嚴重問題。氯霉素殘留可通過食物鏈傳給人類，對人類的健康造成巨大威脅[1]。目前檢測水產品種氯霉素的方法有很多種，其中液相串聯質譜法以其前處理簡單、分析快速準確脫穎而出。本實驗室采用《可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》進行水產品氯霉素藥物殘留的檢測方法。本文在GB/T 20756-2006的基礎上嘗試將超聲波一步提取應用到前處理當中，在保證了檢測方法靈敏度、準確度和精密度完全符合要求的基礎上，使整個實驗進行更加簡單快速。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯霉素標準品德國Dr.E，純度≥98.5% Lot No.90424，氘代氯霉素標準品德國Dr.E 100 μg/mL[1]。乙酸乙酯，Fisher，色譜純；正己烷，沃凱，色譜純；屈臣氏蒸餾水。

1.2 主要儀器

IKA分析研磨機；數控超聲波清洗器KQ-500DE型； 湘儀離心機TDAA-WS； EYELA旋轉蒸發儀；日立高速冷凍離心機 HITACHI CF16RXⅡ[1]；液相串聯質譜儀Wters TQ-S；色譜柱 waters C18柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm。

1.3 試驗部分

1.3.1 標準溶液配制 按照GB/T 20756-2006操作[2]。

1.3.2 樣品前處理 稱取5 g淡水魚肉糜樣品（IKA分析研磨機磨），精確至0.01 g。于50 mL具塞離心管中，加入75μL 氘代氯霉素使用液（20 ng/mL）、15 mL乙酸乙酯，上下振搖混勻1 min，放到數控超聲波清洗器中，超聲頻率40 KHz，超聲功率100%（500 W），超聲15 min，再上下振搖混勻1 min，4 000 r/min離心10 min，取出上清，注意不要吸到水相， 45 ℃旋轉蒸發至干，5～10 mL正己烷渦旋混勻除脂，3 mL屈臣氏蒸餾水溶解，渦旋混勻，靜止分層，取下層水相到1.5 mL塑料離心管12 000 r/min 4 ℃冷凍離心，0.22 μm水相濾膜過濾，得到樣品用于Waters TQ-S液相串聯質譜儀器測定[3]。

1.3.3 液質聯用儀分析條件

1.3.3.1 色譜條件 50 mm×2.1 mm，1.7 μm C18柱；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/ min；流動相為A屈臣氏蒸餾水和B乙腈，采用梯度洗脫：0～2 min，A：B為70%：30%；2 min，A：B為30%：70% ；3 min，A：B為5%：95；4 min，A：B為70%：30%。

1.3.3.2 質譜條件 質譜分析條件見表1，氯霉素及氘代氯霉素的多反應監測譜圖見圖1、圖2。

1.4 檢測方法靈敏度、準確度和精密度

配制0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL 6個不同質量濃度的氯霉素標準溶液，氘代氯霉素的質量濃度為0.5 ng/mL，以質量濃度為橫坐標，峰面積的比值（氯霉素峰面積/氘代氯霉素-D5面積）為縱坐標，繪制標準曲線。選取陰性鰱魚肉糜樣品，添加氯霉素標準品和內標，氯霉素標準品添加水平為0.1 μg/kg、0.3 μg/kg，氘代氯霉素 0.3 μg/kg，每個添加水平3次平行。以公式3C/（S/N）計算理論方法檢出限（LOD），以公式10C/（S/N）計算理論方法檢量限（LOQ）[1]。

2 試驗結果

2.1 檢測方法靈敏度

數據顯示CAP在0.1～2.0 ng/mL范圍內線性關系良好，R2>0.999。根據添加量為0.3 μg/kg的3個樣品152定量離子的最低信噪比和計算公式3C/（S/N），計算理論方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，理論方法定量限為（LOQ）為0.008 μg/kg。

2.2 準確度和精密度

添加量為0.1 μg/kg時回收率為102%～120%，RSD<9% ；添加量為0.3 μg/kg時回收率為90%～104%，RSD<6% 。

2.3 實際樣品的檢測

利用該方法對170個淡水魚樣品（鯉魚、鯽魚、虹鱒、黃顙魚、鰱魚）進行檢測，檢出兩個陽性樣品，其中一個為超標樣品。

3 討論

3.1 超聲波一步提取的初探

超聲波提取在檢測中應用廣泛，在石油烴的提取和藥物殘留的提取中起到增大提取效率提高回收率的效果[4-8]。在采用GB/T 20756-2006進行檢測的過程中，前處理步驟較繁瑣（超聲波提取是其中一步），無水硫酸鈉會使提取液鹽度升高從而影響液質聯用儀的正常運行，而且極有可能引入其他污染物質而影響檢測結果，另外勻質器極有可能引起交叉污染。目前我們在樣品處理時已經把魚肉打成肉糜，因此大膽嘗試了超聲波提取代勻質器一步提取氯霉素的方法，此方法使前處理變得簡單又快速。

3.2 檢測方法靈敏度、準確度和精密度

經過計算，超聲波一步提取淡水魚中氯霉素殘留的理論方法檢出限（LOD）為0.002 μg/kg，理論方法定量限為（LOQ）為0.008 μg/kg。添加量為0.1 μg/kg時回收率為102%～120%，RSD<9%；添加量為0.3 μg/kg時回收率為90%～104%，RSD<6% 。所有數據都滿足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]對準確度和精密度的所有要求。

4 結語

本文總結了在檢測淡水魚氯霉素藥物殘留中采用超聲波一步提取的初步嘗試，實驗以淡水魚（鰱魚）為例做靈敏度、準確度和精密度計算，滿足GB/T 20756-2006[2]以及GB/T 27404-2008[9]對回收率和精密度的所有要求。但僅僅用淡水魚是不夠的，還需要擴大應用范圍，作者還會繼續嘗試在河蟹、海參、海水養殖魚（大菱鲆）等水產品種類的應用。

參考文獻：

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[3] 薄爾琳，鄭懷東，劉學光.同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法快速測定海參中氯霉素[J].中國漁業質量與標準，2013，3（4）：36—41

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[8] 羅曉燕，林玉娜，劉莉治.高效液相色譜法同時測定動物組織中四種抗生素殘留量的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2004，14（4）：443-444

[9] GB/T 27404-2008.實驗室質量控制規范 食品理化檢測[S].北京：中國標準出版社，2008

（收稿日期：2016-05-31）