研究熒光原位雜交技術用于急性早幼粒細胞白血病患者診治中的臨床效果

廖麗娟

【摘要】 目的 研究在急性早幼粒細胞白血病（APL）患者診治中應用熒光原位雜交技術（FISH）的臨床效果。方法 20例疑似APL患者作為研究對象， 應用FISH檢測PML-RARa融合基因， 分析檢測結果。結果 20例患者中確診為APL患者有15例， 其中 PML-RARa融合基因檢測結果為陽性的有14例， 陰性的有1例， 這1例患者經檢查診斷為APL變異型， 誘導治療沒有取得顯著效果；疑似APL的5例患者 PML-RARa融合基因檢測結果都為陰性， 經其他檢查診斷為急性髓細胞白血病M2。PML-RARa融合基因檢測敏感度為93.3%， 特異性為100.0%。結論 FISH能夠準確檢測 PML-RARa融合基因， 提高APL的診斷準確率， 值得推廣。

【關鍵詞】 熒光原位雜交技術；急性早幼粒細胞白血病；診治

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.25.029

APL是一種特殊的急性白血病， 患者會有嚴重的出血傾向， 并且很容易伴發彌散性血管內凝血， 死亡率較高[1]。APL患者中絕大多數都存在特異的染色體易位t， 從而有PML-RARa融合基因形成[2]。PML-RARa融合基因是APL的一項重要指標， 可以作為診斷標準之一。FISH操作簡便， 結果的準確性高[3]。本研究主要分析FISH對于APL的診治效果， 報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年7月～2015年7月收治的20例疑似APL患者， 其中男13例， 女7例， 平均年齡（44.9±9.3）歲， 平均病程（1.42±0.97）年；有9例患者出血是主要臨床癥狀， 其中2例為結膜出血、1例為皮膚紫癜、3例為鼻出血、3例為齒齦出血；有8例患者乏力、頭暈為主要臨床癥狀；有3例患者發熱為主要臨床癥狀。20例患者經臨床診斷確診為APL的患者有15例。

1. 2 方法

1. 2. 1 制備細胞 選取患者1 ml肝素抗凝骨髓， 利用Ficoll對單個核細胞進行分離， 利用0.56%氯化鉀溶液對細胞進行低滲處理， 然后完成固定和滴片。

1. 2. 2 融合基因探針 PML探針為紅色熒光信號， RARa探針為綠色信號。

1. 2. 3 雜交 在70%甲酰胺/2×SSC的溫度為73℃變性液中將玻片浸泡5 min， 然后借助乙醇進行1 min的脫水處理， 氣干待用。在73℃水浴中將探針混合物進行5 min的變性， 滴在45℃預溫的帶雜交玻片上， 然后完成蓋片和封膠處理， 放入37℃的濕盒中進行16～20 h的雜交處理。按照順序浸入73℃ 0.4×SSC、2×SSC/0.1% NP40中進行漂洗， 在避免陽光直射的條件下氣干， 添加10 DAPI進行復染， 然后進行蓋片封片。

1. 3 判定標準 在同一視野下借助顯微鏡利用兩種濾光片對雜交信號進行觀察， PML-RARa融合基因陰性細胞可以觀察到2綠和2紅分離的雜交信號， 陽性細胞可以觀察到1紅1綠和2紅綠融合的4個信號。每例計數>200個中期分裂象， 計算陽性率。陰性對照：選擇10例正常骨髓樣本， 選擇PML-RARa融合基因探針完成FISH檢查， 有陽性信號出現百分率均數為0.8%， 標準差為1.03%， 異常閾值為均數與3倍標準差之和， 最后計算出為3.9%。所以， 陽性病例標準為陽性信號細胞百分率>3.9%。

2 結果

2. 1 15例被確診為APL的患者14例PML-RARa融合基因結果為陽性， 在陽性樣本中， 陽性細胞率在9.5%～80.2%之間（異常閾值=3.9%）， 檢測敏感度為93.3%， 特異性為100.0%；PML-RARa融合基因結果為陰性的患者有1例， 對該患者進一步進行骨髓染色體檢查以及流式細胞學檢查最后診斷為變異型M3。疑似APL的5例患者利用FISH技術檢測PML-RARa融合基因結果顯示都是陰性， 另外進一步骨髓染色體檢查以及流式細胞學檢查也無法診斷為APL。

2. 2 14例PML-RARa融合基因結果為陽性的患者接受并完成誘導治療的患者有12例， 其中2例在10 d內死亡， 其余患者在結束治療后癥狀均有明顯緩解。12例患者中進行維持和鞏固治療的患者有10例， 其余2例失訪。10例接受鞏固維持治療的患者中有9例直到現在仍為緩解狀態， 借助FISH技術檢測PML-RARa融合基因結果都是陰性。在治療期間出現病情加重的患者有1例， 借助FISH技術檢測PML-RARa融合基因結果為陽性， 最后由于心力衰竭死亡。

2. 3 PML-RARa融合基因結果為陰性的1例APL患者進行了誘導治療60 d后還是沒有全部緩解， 借助FISH技術對PML-RARa融合基因進行檢測結果都顯示為陰性， 直到現在病情都沒有得到改善。

2. 4 疑似APL的5例患者， 借助FISH技術對PML-RARa融合基因進行檢測結果都是陰性， 之后經其他方式診斷為急性髓細胞白血病M2。給予常規化療治療后得到有效緩解。

3 討論

近些年對于分子生物學以及細胞遺傳學研究的不斷深入， 以往對于FAB的分型基礎為細胞化學和形態學， 當前逐漸形成了MICM分型， 聯合了分子生物學、細胞遺傳學、免疫學、細胞形態學[4]。以往FAB分型主要不足包括：①由于基礎為細胞化學檢查和細胞形態學， 導致其診斷準確性只有65%左右， 部分APL的細胞形態很容易混淆急性髓細胞白血病M2。②診斷APL一個重要的標準是早幼粒細胞>30%， 另外急性髓細胞白血病M2診斷的一個重要標準是早幼粒細胞>10%， 而計數早幼粒細胞有50%都是靠醫生直接的肉眼觀察[5， 6]。所以這兩類分型的白細胞主觀性比較強。

本研究對PML-RARa融合基因借助FISH技術進行檢測， 結果敏感性為93.3%， 疑似APL的5例患者檢測結果均為陰性， 通過其他各類檢查排除APL， 這也很好的說明了PML-RARa融合基因借助FISH技術檢測的敏感性較高， 用于APL診斷中的價值非常顯著， 值得臨床推廣。

參考文獻

[1] 張濟， 李羿， 李君君， 等.應用RT-PCR和熒光原位雜交監測急性早幼粒細胞白血病微小殘留白血病.中國實驗診斷學， 2012， 16（3）：423-425.

[2] 劉洋， 雷婷， 陳雙， 等.急性早幼粒細胞白血病染色體易位聯合R顯帶和間期熒光原位雜交技術分析.新疆醫科大學學報， 2013， 36（7）：938-941.

[3] 劉小寧， 于亮， 曹維克， 等.一例同時伴有t（7；17；15）和8p-的急性早幼粒細胞白血病的臨床研究.蘇州大學學報（醫學版）， 2011， 31（3）：448-450.

[4] 黃正剛， 陳啟文， 吳星恒， 等.熒光原位雜交技術檢測 PML/RARa 融合基因在兒童 APL 微小殘留病中的應用.實用臨床醫學， 2015， 16（11）：65-68.

[5] 王蓉， 繆扣榮， 仇海榮， 等.間期熒光原位雜交和常規染色體分析診斷急性早幼粒細胞白血病的比較.中國實驗血液學雜志， 2011， 19（4）：983-986.

[6] 吳東升. 三氧化二砷聯合全反式維甲酸治療初治急性早幼粒細胞白血病臨床觀察. 中外醫學研究， 2014， 12（12）：30-31.

[收稿日期：2016-04-22]