外周血Th17細胞對呼吸機相關性肺炎的早期診斷價值

張　鵬　周　健　王耀麗　盧海濱　楊雪飛　馬凌云

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·論著·

外周血Th17細胞對呼吸機相關性肺炎的早期診斷價值

張鵬周健王耀麗盧海濱楊雪飛馬凌云

目的探討外周血Th17細胞水平對呼吸機相關性肺炎(VAP)的早期診斷價值。方法收集本院2011年04月至2015年04月510例機械通氣時間超過48 h患者的臨床資料，根據是否發生VAP將其分為VAP組(95例)與非VAP組(415例)。采用流式細胞儀檢測二組患者的外周血Th17細胞水平，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞因子白細胞介素-17(IL-17)、白細胞介素-6(IL-6)水平，并同時記錄臨床肺部感染評分(CPIS)情況，分別比較二組患者外周血Th17細胞及IL-17、IL-6水平的差異以及Th17細胞水平與CPIS評分的相關性，評價外周血Th17細胞水平對VAP患者的早期診斷價值。結果VAP組患者外周血Th17細胞及IL-17、IL-6水平明顯高于非VAP組患者(P<0.05)；經過抗感染治療后，VAP組患者外周血Th17細胞、IL-17、IL-6水平及CPIS評分均較治療前顯著降低(P<0.05)。相關性分析顯示，外周血Th17細胞水平與CPIS評分呈顯著正相關(r=0.69，P<0.01)。ROC曲線分析顯示，以外周血Th17細胞比例>7.4 %為早期診斷VAP界限時，診斷VAP的敏感性和特異性分別為83.6%和89.1%，ROC曲線下面積(AUC)為0.885(95%CI0.794～0.918)。結論VAP患者早期外周血Th17細胞水平顯著升高，并且與CPIS評分具有較好的相關性，檢測外周血Th17細胞水平可作為早期診斷VAP的有效指標。

呼吸機相關性肺炎；輔助Th17細胞；白細胞介素-17；診斷，早期

呼吸機相關性肺炎(ventilator associated pneumonia, VAP)是指患者經機械通氣大于48 h所形成的肺部感染，其發病率高，預后差，嚴重威脅患者身體健康，同時顯著延長危重患者住院時間、增加其住院費用，給患者及社會帶來沉重的經濟負擔[1-2]。因此，如何對VAP患者進行早期診斷，進而針對VAP患者進行個體化治療，對改善患者預后具有重要的臨床意義。輔助性T細胞17(T helper cell 17, Th17)是近些年發現的一類新的淋巴細胞亞群，在多種免疫及感染性疾病中起著重要的作用，同時對于感染性疾病的早期診斷也具有較高的敏感性和特異性[3-5]。Th17細胞是否能對VAP進行早期診斷，目前相關研究尚未闡明。因此，本研究通過檢測VAP患者外周血Th17及白細胞介素-17(interleukin-17, IL-17)水平，并分析Th17細胞與肺部感染評分(clinical pulmonary infection score, CPIS)的相關性，以期探討Th17細胞在早期診斷VAP中的臨床價值。

資料與方法

一、臨床資料

選取2011年4月至2015年4月，在本院重癥醫學科行機械通氣>48 h的510例患者作為研究對象，其中男295例，女215例，平均年齡(56.8±12.4)歲。根據是否發生VAP將其分為VAP組(95例)與非VAP組(415例)。VAP的診斷標準參照中華醫學會2013年制定的《呼吸機相關性肺炎診斷、預防及治療指南》[6]：①使用呼吸機輔助通氣時間≥48 h或脫機≤48 h；②胸部X線檢查可見肺部出現新的或進展性浸潤陰影；③發熱：體溫升高(>38 ℃)，同時呼吸道出現大量膿性分泌物；④外周血白細胞>10.0×109/L或<4.0×109/L；⑤呼吸道分泌物經培養出現新的病原菌。排除標準：①機械通氣時間≤24 h的患者；②機械通氣以前已經確診為肺炎的患者；③機械通氣不能耐受，終止治療的患者；④有嚴重免疫抑制的患者。兩組間在年齡、性別、基礎疾病及機械通氣時間等方面，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得了醫院倫理委員會的批準，并得到了患者及家屬知情同意。

二、研究方法

1. 記錄入選患者的一般臨床資料： 所有患者均給予氣管插管行機械通氣，同時給予祛痰、補液、營養支持等對癥治療。詳細記錄兩組患者性別、年齡、機械通氣時間、血常規、基礎疾病、機械通氣天數等臨床資料。同時對兩組患者進行CPIS評分，評價患者肺部感染程度。對于VAP患者，根據血培養及藥敏試驗結果，選用相應抗生素進行治療。

2. 外周血Th17細胞檢測： 收集VAP組治療前后及非VAP組清晨空腹靜脈血3 ml，加入肝素抗凝及等體積淋巴細胞分離液后梯度離心，以離心半徑8 cm，1 500r/min 離心15 min，分離得到外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)懸液，采用血球計數板計算PBMC數量。6孔板培養PBMC，每孔加入RPMI-1640培養基1 ml，佛波酯(50 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)及莫能菌素(0.7 μg/ml)吹打混勻，孵育4 h。加入抗人CD4單抗20 μl，室溫避光孵育20 min。再通過加入染色緩沖液2 ml及抗IL-17單抗20 μl，室溫孵育15 min，此后以離心半徑8 cm，1 500 r/min 離心10 min，棄上清，加入染色固定液1 ml，等待上機檢測。

3. ELISA檢測血漿IL-6、IL-17的含量: 采用ELISA法檢測VAP組治療前后及非VAP組外周血IL-6、IL-17水平，整個操作按試劑盒說明步驟進行，試劑盒由武漢博士德生物公司提供。

三、統計學方法

結　　果

一、VAP組與非VAP組外周血Th17及細胞因子水平

與非VAP組相比，VAP組患者外周血Th17細胞及細胞因子(IL-17、IL-6)顯著高于非VAP組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1　兩組外周血Th17及細胞因子水平

注：與非VAP組比較，aP<0.05；Th17: 輔注性T細胞；IL-17：白介素-17；IL-16: 白介素-16

圖1兩組外周血Th17細胞水平比較

二、VAP組患者治療前后臨床指標比較

經過有效的抗菌治療后，VAP組患者外周血Th17細胞及細胞因子(IL-17、IL-6)水平較治療前明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；同時治療后VAP組CPIS評分也顯著低于治療前，差異具有統計學意義(P<0.05)，其中，在治療7 d內，VAP組患者因病情加重死亡8例，見表2。

表2　VAP組患者治療前后外周血Th17、IL-17、IL-6及CPIS評分比較

注：與治療前比較，aP<0.05；Th17: 輔注性T細胞；IL-17：白介素-17；IL-16: 白介素-16

三、外周血Th17細胞比例與CPIS評分相關分析

VAP組患者外周血Th17細胞比例與CPIS評分進行相關分析，結果顯示兩者呈顯著正相關(r=0.69，P<0.01)，即外周血Th17細胞比例越高，VAP肺部感染程度越重，CPIS評分也相應升高，見圖2。

圖2VAP組患者外周血Th17細胞水平與CPIS評分的相關性

四、外周血Th17細胞水平對VAP早期診斷的ROC曲線分析

通過ROC曲線分析發現外周血Th17細胞水平的AUC為0.885(95%CI0.794～0.918)，其OOP分別為7.4 %，提示外周血Th17細胞比例>7.4 %，此時早期診斷VAP的精確率較高(敏感性為83.6%和特異性為89.1%)，見圖3。

圖3 外周血Th17細胞水平的ROC曲線

討　　論

VAP是指機械通氣超過24 h或脫機48 h內發生的肺炎，是醫院獲得性肺炎最常見的類型，病情常進行性加重，嚴重威脅患者身體健康[7]。目前，VAP的發生率及死亡率均較高，雖然其確切的發病機制仍不太清楚，但大量的研究已顯示，反復的肺部炎癥在VAP的發生發展過程中起著重要的作用[8]。其中，中性粒細胞及淋巴細胞的異常活化是VAP發生的關鍵因素。隨著中性粒細胞的增加，肺部炎癥越顯著，病情越危重[9-10]。是什么因素導致VAP患者中性粒細胞的大量活化與聚集，其具體的機制尚不完全清楚，但目前研究顯示可能與T淋巴細胞釋放的炎性趨化因子的作用有關。

Th17是一類近些年來發現的淋巴細胞亞群，其主要分泌IL-17，發揮相應的效應[11]。相關研究證實，在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中，特別是在膿毒癥、支氣管哮喘及慢性阻塞性肺疾病等患者中，其外周血中Th17細胞比例及IL-17明顯高于健康對照者，并且隨著疾病嚴重程度的加重，Th17細胞及IL-17水平也明顯增加[12]。IL-17作為重要的炎性細胞因子，其水平的增加可引起氣道上皮細胞釋放IL-6及IL-8等致炎因子及趨化因子的增加，從而促進中性粒細胞募集到肺部組織，引起炎癥的進一步加重[13-14]。可見，Th17細胞的活化是促進炎癥性疾病發生發展的重要環節之一。但是否Th17與VAP的發生發展有關，目前相關研究尚未闡明。針對VAP患者尋找一項指標，能早期的對其進行診斷，對于臨床個體化治療具有重要的意義。在本研究通過對VAP與非VAP患者外周血Th17細胞水平及相關細胞因子進行了檢測，結果發現VAP患者外周血Th17細胞水平顯著高于非VAP組患者，同時細胞因子IL-17和IL-6也顯著較非VAP組升高，表明VAP患者體內炎癥水平明顯高于非VAP組。隨著VAP組患者經過相應治療后，外周血Th17細胞水平及相應細胞因子呈現明顯降低趨勢，表明Th17細胞水平的變化可在一定程度上反映VAP患者的治療效果。臨床上，VAP患者肺部感染程度常用CPIS評分來進行評價，其評分越高，表明患者肺部感染程度越重[15]。本研究通過相關性分析顯示，外周血Th17細胞水平與CPIS評分呈顯著的正相關，即外周血Th17細胞水平越高，CPIS評分也越高。進一步探討外周血Th17細胞水平對早期診斷VAP的精確性，本研究發現以外周血Th17細胞比例>7.4%作為早期診斷VAP的界限時，診斷VAP的敏感性為83.6%，特異性為89.1%。相關研究顯示，通過抑制炎癥性疾病患者體內Th17細胞及其分泌的IL-17水平，可以顯著降低炎癥反應，改善患者臨床預后[12]。針對VAP患者，通過檢測外周血Th17細胞水平，其不僅可作為早期診斷VAP的有效指標，還可能為其治療提供新的靶點。

上述研究表明，外周血Th17細胞水平能有效的對VAP患者進行早期診斷，從而為患者的早期個體化治療提供臨床依據。但由于本研究VAP患者樣本量偏少，尚需要進一步擴大樣本量，采取多中心聯合的方式對外周血Th17細胞水平在早期診斷VAP的臨床價值方面做進一步的研究。

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(本文編輯：張大春)

張鵬，周健，王耀麗，等. 外周血Th17細胞對呼吸機相關性肺炎的早期診斷價值[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(2)： 150-153.

Early diagnosis value of peripheral Th17 cells levels on ventilator associated pneumonia

ZhangPeng,ZhouJian,WangYaoli,LuHaibin,YangXuefei,MaLingyun.

DepartmentofIntensiveCareUnit,DapingHospital&InstituteofSurgeryResearch,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,ChinaCorrespondingauthor：MaLingyun,Email:malingyuncq01@163.com

ObjectiveTo study the clinical value of Th17 cell levels on the early diagnosis of ventilator associated pneumonia (VAP). MethodsA total of 510 patients, who undergone mechanical ventilation over 48 h in our hospital from April 2011 to April 2015 were enrolled in the study. According to the related infections, these patients were divided the VAP group (95 cases) and non-VAP group (415 cases). The percentages of Th17 cells were measured by flow cytometry, Serum levels of cytokines, interleukin-17 (IL-17), interleukin-16(IL-6) were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and clinical pulmonary infection score(CPIS) score were analyzed. The differences of Th17 cells levels and IL-17, IL-6 were compared and correlation with CPIS score were analyzed, which the relationship with the early diagnosis of VAP were also assessed. ResultsTh17 cells, IL-17 and IL-6 levels in VAP group were significantly higher than non-VAP group (P<0.05); After the treatment, the levels of Th17 cells, IL-17 and IL-6 levels, and CPIS score were significantly decreased in VAP group (P<0.05). The Th17 cells levels and CPIS score were positive correlated (r=0.69,P<0.01). ROC curves analysis results showed that with Th17 cell levels>7.4% considered as the boundary for diagnosis of VAP, the sensitivity was 83.6%, the specificity was 89.1%, the area under curve of Th17 cell levels was 0.885 (95%CI0.794-0.918). ConclusionThe peripheral Th17 cells levels of VAP are significantly increased, and have a good correlation with CPIS score. The Th17 cells levels can be used as an early diagnostic maker for VAP.

Ventilator associated pneumonia;Helper T cell 17;Interleukin-17;Diagnosis, early

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.008

國家自然科學基金青年項目(81200057)

400042 重慶，第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所重癥醫學科

馬凌云，Email：malingyuncq01@163.com

R563

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2015-12-05)