侵襲性肺曲霉病的研究進展

陳先華　郝　飛

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·綜述·

侵襲性肺曲霉病的研究進展

陳先華郝飛

曲霉菌；侵襲性肺曲霉病；實驗室診斷

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是指曲霉菌菌絲生長侵入肺實質而引起的感染性疾病；其最常見的感染患者為惡性血液病以及實體器官和造血干細胞移植的患者[1]。由于煙曲霉菌的血培養通常顯陰性，并且通過支氣管肺泡灌洗從下呼吸道取樣來進行曲霉菌的培養通常不夠靈敏，所以IPA的診斷比較復雜。近年來，非培養的診斷方法不斷發展起來，包括成像檢查，PCR技術，抗原檢測等[2]。雖然歐洲癌癥治療與研究組織(European Organisation for the Research Treatment of Cancer )及美國真菌病研究工作組(US Mycoses Study Group)均制定了侵襲性真菌感染和診斷的標準[3]；我國2006 年中華內科雜志編輯委員會也制訂了《侵襲性肺部真菌感染的診斷標準與治療原則( 草案) 》，但臨床檢驗并沒有完全按照這些標準來執行[4]。為提高IPA的早期診斷水平，現結合國內外文獻資料復習并討論近年來IPA早期診斷的研究熱點，旨在確定一個有利于對于肺部IPA疾病的針對性治療以及改善治療效果的診斷策略，而不是一味地進行經驗治療。

一、概述

1. 病因學：IPA最常見的病原體為煙曲霉菌(A. fumigatus)，為環境中常見的霉菌，由于其孢子較小，較易侵犯肺實質，亦會累及胸膜、氣管以及細支氣管；此外，機體37 ℃的體溫也為其生長提供了良好的條件[5]。

2. 流行病學：侵襲性曲霉病可以引起免疫功能低下患者的嚴重機會感染，尤其是發生在中性粒細胞水平降低的患者中，體外研究顯示中性粒細胞具有殺死曲霉菌的作用，中性粒細胞減少的患者肺部具有較高的侵襲性曲霉病感染的風險，包括慢性阻塞性肺病的患者、嚴重肝病患者及重癥監護的患者，以及感染H1N1病毒的患者和手術患者[6]。HIV感染患者感染曲霉病的風險較低，由于其免疫缺陷表現在CD4細胞，其基本不參與曲霉菌的發病過程，但是也有艾滋病患者發生侵襲性曲霉病的報道。慢性肉芽腫的患者具有發生一種特異性的IPA的風險，主要表現為爆發性的肺炎。近年來，也有對IPA的易感性進行的研究。缺乏甘露糖結合凝集素的人群，或者該凝集素突變的人群可能有更高的IPA的發病風險[7]。

3. 預后：近20年來，IPA患者的治療效果有了較大的進展。在1990年，異體造血干細胞移植患者由于IPA的病死率高達94%，但在2009年的統計顯示，造血干細胞移植的患者12周的病死率約為35%。歐洲的一個關于惡性血液病患者的臨床試驗顯示，患者12周的病死率為42%，并且在2004年至2009年間有較大幅度的降低[8]。一項關于兒童的IPA患者的研究顯示，3年的生存率為55%[9]。但是，IPA所致的死亡仍舊是影響患者短期以及長期生存率的重要因素。在患有急性骨髓性白血病的患者中進行的研究顯示，曲霉菌感染患者的2年生存率為14%，而未感染的患者2年生存率為32%[10]。美國的一項研究顯示，曲霉菌感染的患者與未感染的患者相比，具有明顯更高的病死率，花費更多的治療費用，同時治療時間明顯延長[11]。

4. 診斷：IPA患者的癥狀和體征表現均非特異性，并且通常在臨床治療中，由于患者發熱可能會經驗性地給予抗菌藥物治療，治療效果不明顯。炎癥反應的生物標志物如C-反應蛋白或降鈣素的表現也非特異性，但可用于檢測確診的IPA患者的治療效果。對于IPA的比較具有特異性的診斷方式包括：成像、直接顯微鏡檢、組織病理學檢查、病原培養、抗原檢測以及DNA檢測。常見的診斷方式及其優劣，見表1。

表1　常見的侵襲性曲霉病的實驗室診斷方法

有研究評價了采用胸部高分辨率CT斷層掃描的診斷方法具有較好的特異性，目前，該方法已經成為疑似IPA患者的重要檢測手段。更重要的是，該方法中暈輪信號對于識別侵入血管壁的曲霉菌具有較好的特異性，其他的信號如樹芽狀、節段組合結構顯示可能與呼吸道疾病有關[12]。但是，有研究對患有侵襲性曲霉病患者或者非淋巴瘤的70例患者進行了研究，顯示單純依靠CT成像進行IPA的診斷是很困難的，因其不具有足夠的敏感性和特異性[13]。

每一種疾病的診斷都會遇到一個問題，那就是新的標記物出現以后，怎么與舊的標記物進行比較。對于IPA的診斷，仍然存在這樣的問題，并且限制了半乳甘露聚糖檢測這一以往常用于診斷IPA的方法在血清樣本檢測中的應用。目前，該方法可能只能用于檢測少數患者的支氣管肺泡灌洗液，并且該疾病的診斷還必須有活組織培養或者活檢的陽性結果。

二、IPA診斷方法

1. 直接顯微鏡檢查：診斷IPA最簡單的方法之一為采用適當的標本進行直接顯微鏡檢查。但是這種方法缺乏特異性，由于曲霉屬真菌很少在體內產生孢子，并且采用這種方法看到的菌絲不能反映真菌的數量。文獻報道此方法的靈敏度在0%～90%[14]，差異之大可能與試驗方法不同有關，特別是有的方法可能用到了熒光增白劑。

2. 組織病理學檢查：采用活檢或者尸檢材料進行組織病理學檢查可為是否存在侵襲性的真菌感染提供診斷證據。由于從組織切片中根據菌絲鑒別真菌的種類是很困難的，因此還需要通過曲霉菌的培養，獲得陽性的結果，才能進行侵襲性曲霉病的診斷。組織病理學檢查對于診斷侵襲性真菌病是很有價值的，但是在大多數情況下，特別是在肺部發生侵襲性真菌感染的時候，可能由于患者血小板計數太低或者一些其他的相關風險，通過胸廓穿刺活檢是屬于禁忌的。在一項病例系列研究中，只有40%的患者采用了支氣管肺活組織檢查，在其組織中檢測到了真菌菌絲，其他的患者均由于血清培養陽性或者半乳甘露聚糖抗原檢測陽性而診斷為侵襲性曲霉病。通過組織切片檢查，曲霉屬真菌的菌絲是非常窄的，直徑一般在1～3 μm，很難和其他的一些真菌進行區別。有研究采用免疫組化標記的方法來對固定組織切片中的真菌細胞進行鑒別，但是鑒于其技術上的要求，并且很少有臨床的樣本材料采用這樣的方法進行分析，因此很難對這種方法在臨床檢驗過程中進行普及。在還沒有對組織樣本進行培養的情況下，采用PCR的方法來進行固定組織樣本中菌絲的鑒別還是很有用的[15]。

3. 培養：在采用半乳甘露聚糖抗原檢測以及PCR等特異性較好的實驗室檢查之前，通過臨床樣本的培養獲得陽性的結果是傳統進行侵襲性曲霉病的診斷方法。樣本的陽性培養產物也可以用于一些其他的檢測，比如藥敏試驗。從技術層面上來看，大多數的曲霉菌的生長都比較快，在多數的微生物培養介質及血瓊脂中都能很好的生長。有研究顯示把孵育的時間從2d延長至5d可以增加17%的培養數量[16]。由于進行病原的培養比較簡單并且花費很低，有研究報道了一種可以增強該方法的靈敏度，并可以快速并且特異性地檢測洋地黃固定的曲霉菌菌落的方法。通常通過對菌落以及其顯微形態學的檢查，來對培養的曲霉屬真菌進行鑒別是比較容易的。近年來，一些新的非典型的曲霉屬真菌得到確定，并且對其DNA序列也進行了測定。

4. 半乳甘露聚糖抗原檢測：半乳甘露聚糖是一種碳水化合物分子，具有一個由甘露糖殘基組成的骨架，該殘基具有β1-5連接的呋喃半乳糖殘基。在1992年，就有研究報道了對該分子進行檢測的方法，該方法采用了一種單克隆抗體EB-A2，它可以與4個呋喃半乳糖殘基特異性的結合，從而進行半乳甘露聚糖的檢測[17]。通常在中性粒細胞減少的血液病或者造血干細胞移植的患者中都可以從血清中檢測到半乳甘露聚糖，通過高分辨的CT可以檢測到曲霉菌侵入了血管，也進一步證明了只有侵入血管后才會有半乳甘露聚糖的釋放。相反，在慢性肉芽腫患者中，侵襲性曲霉病的特征主要表現在肺膿腫，通常會限制霉菌侵入血管，因此血清半乳甘露聚糖檢測的結果一般是陰性。對動物模型以及侵襲性曲霉病患者的研究均顯示，葡聚糖在血清中有較高水平的分布，血清葡聚糖檢測是侵襲性曲霉病診斷的一個較好的標記物。有研究采用本法檢測了30個懷疑患有侵襲性曲霉病的患者，63%的患者檢測結果均為陽性，而對照組73%的患者為陰性[18]。但是患有其他真菌感染的患者采用本法檢測也可能為陽性，包括假絲酵母菌、鐮刀菌屬、枝頂孢屬、肺囊蟲病以及莢膜組織胞漿菌等[19]。因此，葡聚糖是IPA檢測的一個不具有較好特異性的標記物。

5. 曲霉菌DNA檢測：在1988年聚合酶鏈反應(PCR)發明后不久，已有研究報道如何從樣本中進行DNA的提取，并且通過PCR的方法進行曲霉菌DNA的檢測，從而對動物模型或者患者進行疾病的診斷[20]。但是，對于定植和感染的區別限制了該方法的使用。1997年，有人從中性粒細胞減少的血液病患者血液中進行了DNA的提取，并且對13例患有侵襲性曲霉病的患者，采用斑點印跡法進行全真菌引物探測曲霉菌DNA，并對大亞基rRNA進行了擴增[21]，其后該技術得到了廣泛的關注和發展。但是，由于目前不同的研究文獻中采用的DNA的提取方法，PCR方法，以及產物的檢測方法各有不同，缺乏標準化以及各種不同方法的比較，因此還沒有商業的標準化的PCR檢測試劑盒，導致DNA檢測方法還沒能列入歐洲癌癥治療研究組織(EORTC)對IPA感染的診斷標準中[22]。

6. 其他侵襲性曲霉病的生物標記物：近年來，見有一些新的檢測方法報道。新近一種測定只有在霉菌生長的時候才會產生的細胞外的糖蛋白抗原檢測方法，被稱之為測流裝置，該方法對采用半乳甘露聚糖和葡聚糖檢測診斷為侵襲性曲霉病的患者進行檢測時，顯示出較好的特異性。另外采用侵襲性曲霉病的豚鼠模型進行研究，顯示胞外糖蛋白抗原作為標記物要早于半乳甘露聚糖和葡聚糖出現[23]。其他建議作為標記物的煙曲霉抗原包括存在于生長的霉菌表面的Cf2和細胞壁相關抗原，膠毒素及其衍生物[24]。

曲霉菌的血清抗體可作為侵襲性曲霉病的一種診斷方法，但是，在免疫功能低下的患者中，對曲霉菌感染的抗體應答一般比較差。但對于非中性粒細胞減少患者的診斷，以及患者在清髓性化療以及干細胞移植之前，對于抗體的檢查是非常有用的[25]。在非免疫功能低下的患者，如COPD患者，對曲霉菌的抗體應答可能是比較有意義的。

對IPA患者進行呼吸測試臨床已有使用。最近的一項研究顯示，在2例患者的測試中成功檢測到2-正戊基呋喃，推測這種新的方法可能為診斷IPA提供新的證據并且有關這種超低介入的研究方法值得進一步試驗研究[26]。

近年來，多種研究措施和方法都在努力地想要實現肺部IPA的準確鑒別和診斷，以此在患者治療方案中獲益。在曲霉病診斷和治療中也有了較大的進步，但是其與疾病相關的病死率并沒有成比例的減少[27]。在免疫功能低下的高風險患者中，特別是那些中性粒細胞減少的患者，雖然目前對其疾病特點有了一定的了解，并對慢性肺病患者的IPA的診斷和治療也采用了特殊的方法[28]。但并不能減少中性粒細胞低于正常水平患者的死亡率。對于IPA診斷方法的研究仍是一個挑戰，但有理由相信隨著對曲霉菌菌體抗原成分和結構特性研究的發展，其臨床的診斷和治療將得到不斷的改進。

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(本文編輯：張大春)

陳先華，郝飛. 侵襲性肺曲霉病的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(2)： 201-203.

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.022

國家自然科學基金資助項目(81271753)

400038 重慶，第三軍醫大學西南醫院皮膚科

陳先華，Email：chenxianhua137@sina.com

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2016-01-09)