3-BrPA對肺癌A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用研究

唐　青　胡義德

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·論著·

3-BrPA對肺癌A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用研究

唐青胡義德

目的探究3-BrPA對肺癌A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用及其機制。方法①細胞培養: RPMI1640培養基培養肺癌A549細胞及人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP細胞；②采用CCK8及Western blot法觀察3-BrPA對A549/DDP細胞的耐藥逆轉作用和P-糖蛋白(P-glycoprote, P-gp)的表達水平；采用流式細胞術檢測不同濃度3-BrPA作用A549 /DDP細胞后細胞內羅丹明-123(Rhodamine-123，Rh123) 的蓄積情況。結果順鉑對A549細胞、A549/DDP細胞及3-BrPA作用后的A549/DDP細胞的IC50分別為6.714 μg/ml、38.99 μg/ml及12.86 μg/ml，逆轉倍數為3.03，相對逆轉效率為81%。3-BrPA可使A549/DDP細胞的P-gp表達下調。3-BrPA可使A549/DDP細胞內的Rh123蓄積增多并呈劑量依賴性。結論3-BrPA可逆轉A549/DDP細胞對順鉑耐藥，作用機制可能與其抑制P-gp的功能和表達有關。

支氣管肺癌；3-BrPA；A549/DDP細胞；耐藥逆轉

肺癌是全球范圍內病死率居于首位的惡性腫瘤，順鉑(DDP)是治療肺癌較為有效的化療藥物之一[1]。但臨床上許多肺癌患者在經歷了最初的化療之后，仍然出現復發和轉移, 其失敗的主要原因是腫瘤細胞產生了多藥耐藥(multiple drug resistance, MDR)[2]。經大量研究證實: P-糖蛋白(P-gp) 過度表達是產生MDR 的主要原因[3-4]。自從維拉帕米等第一代MDR逆轉劑問世以來，已有一批針對各種MDR相關ABC轉運蛋白的腫瘤MDR逆轉劑相繼進入臨床試驗階段[4-6]。其中糖酵解己糖激酶抑制劑3-BrPA給MDR逆轉劑的研究帶來了一個新的熱潮。近幾年國外研究表明，3-BrPA是一種強烷化劑，其能通過抑制腫瘤細胞糖酵解過程中的己糖激酶，減少腫瘤細胞ATP的產生，從而導致大量腫瘤細胞凋亡[7-8]。已有文獻報道3-BrPA可增敏鉑類藥物對耐藥細胞株的殺傷作用[9-10]。因此，本實驗將3-BrPA作為研究對象，探討其對A549/DDP細胞是否具有耐藥逆轉作用，并觀察對P-gp蛋白功能和表達的影響。

材料與方法

一、 實驗材料

1. 細胞株： 人肺腺癌耐順鉑A549/DDP細胞(購于上海義森生物科技有限公司)、人肺腺癌A549細胞(本實驗室前期保存)。

2. 主要試劑： RPMI1640、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶(購于Hycoly公司)；胎牛血清(購于Gibco公司)；5 mg/ml順鉑注射液 (購于Sigma公司)；3-BrPA (購于Alfa Aesar 公司)；CCK8試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(購于碧云天公司)；硝酸纖維素膜(購于Millipore公司)；PGP兔單克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術有限公司)；ECL發光試劑盒(advansta公司)。

二、實驗方法

1. 將A549細胞培養在RPMI1640培養液(含10%胎牛血清)中，將A549/DDP細胞培養在含15%胎牛血清、0.5 μg/ml順鉑(維持濃度)的RPMI1640培養液中，兩種細胞置于37 ℃、 5% CO2恒溫孵箱中培養。

2. CCK8實驗檢測: 3-BrPA對A549/DDP細胞的增殖抑制作用：用胰蛋白酶將鋪滿細胞培養瓶底的A549/DDP細胞消化后制成單細胞懸液接種于96孔培養板,使每孔含A549/DDP細胞約5 000個，加入培養液使得每孔終體積為200 μl。將96孔板置于37 ℃、 5% CO2恒溫孵箱中培養24 h后吸除孔內廢棄培養液，設置實驗組和對照組。實驗組分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/ml濃度梯度的3-BrPA，空白對照組僅加入200 μl培養液，陰性對照組僅含A549/DDP細胞的單細胞懸液200 μl。每組設三個平行復孔，再放入孵箱分別培養24 h、48 h、72 h后吸除孔內培養液，分別加入200 μl培養液和10 μl CCK8，置于37 ℃、 5% CO2培養箱中繼續培養1～3 h。全自動酶標儀測定各孔450 nm處OD值，試驗重復三次以上。增殖抑制率(%)=1-(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。規定生長率>90%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性劑量，并作為最佳逆轉耐藥濃度。

3. CCK8實驗檢測3-BrPA對A549/DDP細胞的耐藥逆轉作用：將A549細胞及A549/DDP 細胞消化、離心后用培養液調整細胞數為5×104/ml。取100 μlA549/DDP細胞懸液(約5 000個細胞)加入96 孔板，每組設置三個平行復孔。將96孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養24 h后吸除孔內廢棄培養液，設置實驗組和對照組。實驗組分別先加入無毒劑量的3-BrPA后，依次加入濃度梯度為2.5，5，10，20，40 μg/ml的順鉑，同時設只加入順鉑 (濃度梯度同上)的陽性對照組；再取100 μl A549細胞懸液(約5 000個細胞)加入96孔板，加入順鉑(濃度梯度同上)和培養液。同時設置空白對照組和陰性對照組，實驗重復3次以上。按CCK8實驗測定450 nm處各孔吸光度OD值，取三孔平均值計算細胞增殖抑制率。通過Graphpad.prism.v5.01軟件分別計算A549細胞、A549/DDP 細胞及A549/DDP 細胞加入3-BrPA后抑制率為50%時的順鉑濃度即IC50，再按照以下公式計算耐藥倍數、逆轉倍數及相對逆轉效率。

耐藥倍數RF= A549/DDP 細胞IC50/A549細胞IC50

逆轉倍數RI= A549/DDP 細胞IC50/A549/DDP 細胞加入逆轉劑IC50

相對逆轉效率= (A549/DDP 細胞IC50-A549/DDP 細胞加入逆轉劑IC50) /(A549/DDP 細胞IC50-A549細胞IC50)

4. Western blot 法檢測P-gp的表達：將處于對數生長期的A549細胞、A549/DDP細胞以及3-BrPA作用48 h后的A549/DDP細胞消化離心、冰上裂解后移入EP管中用BCA法測定蛋白濃度。上樣時每組取40 μg 的蛋白樣品，用5% SDS-PAGE膠垂直電泳分離(濃縮膠80 V，30 min；分離膠120 V，100 min)，轉至PVDF膜上后，室溫下封閉1 h，孵一抗(PGP、GAPDH 均1︰1 000) 4 ℃過夜; TBST洗膜每次10 min，共4次，再加入二抗(山羊抗兔IgG1︰3 000)，37 ℃孵育1 h ，TBST洗膜5 min，共3次，ECL發光試劑盒顯影，實驗重復三次以上。

5. 流式細胞儀檢測P-gp 的功能：將對數生長期的A549/DDP細胞經消化、離心后用1 640培養液制成1×106/ml 細胞懸液，取100 μlA549/DDP細胞懸液加入6孔板中，設置陰性對照組(PBS)、實驗組1、2、3(3-BrPA濃度分別為6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml)每組設置三個復孔。放進37 ℃、5% CO2培養箱孵育24 h后胰酶消化，將培養細胞用PBS漂洗1次，制成單細胞懸液，37 ℃孵育30 min，每管加入終濃度達5 μg/ml的Rh123，再在37 ℃孵育40 min，以離心半徑8 cm，1 500 r/min離心2 min，棄上清，用冷凍PBS重新懸浮，轉移0.5 ml入流式上樣管。用FACSCalibur流式細胞儀檢測平均熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。

三、統計學方法

結　　果

一、3-BrPA對A549/DDP細胞的增殖抑制作用

CCK8實驗結果顯示，當3-BrPA濃度從3.125 μg/ml增加到100 μg/ml時，對A549/DDP細胞的24 h抑制率也從(1.95±2.24)%上升至(49.45 ±2.95)%，100 μg/ml的3-BrPA分別作用24 h、48 h、72 h后的抑制率為(49.45 ±2.95)%、(56.16±2.56)%、(64.05±3.06)%，說明3-BrPA能不同程度的抑制A549/DDP細胞生長，并且具有時間-劑量依賴性，即隨著3-BrPA濃度和作用時間的遞增，對細胞的抑制作用越來越明顯，與對照組相比差異均具有統計學意義(P<0.05)(結果見表1，圖1)。按上述規定6.25 μg/ml及以下濃度的3-BrPA對A549/DDP細胞無明顯細胞毒性，即將濃度5 μg/ml作為3-BrPA后續工作濃度。

表1　3-BrPA對A549/DDP細胞增殖抑制的量效時效關系

圖13-BrPA對A549/DDP細胞的增殖抑制作用

二、3-BrPA對A549/DDP細胞的耐藥逆轉作用

實驗結果顯示A549細胞及A549/DDP細胞的抑制率隨順鉑濃度的增加而呈遞增趨勢相同濃度的順鉑對A549/DDP細胞的抑制率在加入5 μg/ml 3-BrPA干預后較干預前顯著增高(P<0.05)，說明3-BrPA與順鉑聯用可增強順鉑的抗腫瘤作用(見表2、圖2、3)。通過Graphpad.prism.5.0軟件計算得到A549細胞及A549/DDP細胞的IC50分別為6.714 μg/ml、38.99 μg/ml，耐藥倍數為5.81,3-BrPA作用后的A549/DDP細胞的IC50為12.86 μg/ml，耐藥逆轉倍數為3.03，相對逆轉效率為81%。

表2　3-BrPA對A549/DDP細胞的耐藥逆轉作用

圖2順鉑對A549細胞及A549/DDP細胞的生長抑制曲線

圖35 μg/ml 3-BrPA對不同濃度順鉑作用下的A549/DDP細胞的增殖抑制作用

三、3-BrPA對P-gp表達的影響

P-gp是存在于腫瘤細胞膜上的一種能量依賴性藥物外排泵，與抗腫瘤藥物結合后通過ATP水解提供能量, 將化療藥物逆濃度梯度從胞內轉運到胞外,降低細胞內藥物積聚, 從而導致耐藥現象的發生。本實驗Western blot檢測結果表明，與親本A549細胞相比，A549/DDP細胞存在P-gp過表達現象，而在加入5 μg/ml的3-BrPA作用48 h后，P-gp表達明顯降低(P<0.05)，差異具有統計學意義(見圖4)。

圖43-BrPA對P-gp表達的影響;注：1：A549細胞 2：A549/DDP細胞 3：加入5 μg/ml 3-BrPA處理48 h后的A549/DDP細胞

四、3-BrPA對P-gp功能的影響

Rhodamine -123是一種陽離子熒光染料，也是P-gp的特異底物，P-gp能夠利用水解ATP的能量，將細胞內的Rh123泵出細胞外，降低Rh123的胞內蓄積，因此可通過檢測腫瘤細胞內Rh123 熒光強度的變化來反應細胞表面P-gp的功能[11]。流式結果顯示與陰性對照組相比，加入3-BrPA作用后的三個組平均熒光強度(MFI)均有所增強，并且具有劑量依賴性(見圖5)。說明3-BrPA可降低P-gp功能，減少Rh123外排，增加Rh123胞內蓄積。

圖5不同濃度3-BrPA對A549/DDP細胞內Rh123蓄積的影響

討　　論

肺癌是發病率和病死率較高的惡性腫瘤，目前最主要的治療方式仍是以化療為主，但影響化療療效并導致化療失敗的關鍵在于腫瘤細胞產生的耐藥性。1976年Juliano首先發現P-gp與腫瘤細胞MDR有關。P-gp是依賴ATP的膜轉運蛋白，P-gp與藥物結合，ATP水解后所釋放的能量使藥物轉運出細胞外，從而導致細胞內藥物濃度下降，同時可通過主動轉運將細胞內的毒性藥物移到胞外，細胞由此產生耐藥性[12-15]。維拉帕米是目前公認的耐藥逆轉劑，其通過影響P-gp功能，抑制細胞內藥物轉運出細胞外而達到逆轉耐藥的作用[16-17]，但因其有效劑量下的毒副作用嚴重而在臨床運用中受到了限制。因此尋找到一種高效低毒的耐藥逆轉劑已成為腫瘤化療領域的新思路。

本實驗結果顯示，3-BrPA能明顯抑制A549/DDP細胞生長，并且隨著3-BrPA濃度的逐漸增高和作用時間的延長，A549/DDP細胞的存活率也逐漸降低，說明3-BrPA是一種有效的腫瘤抑制藥物。與對照組相比，順鉑對A549/DDP細胞的抑制作用在加入逆轉濃度的3-BrPA后明顯增強，IC50由38.99 μg/ml降到12.86 μg/ml，耐藥逆轉倍數為3.03。由此可見，3-BrPA在自身發揮抗腫瘤作用抑制肺癌細胞生長的同時，還能作為一種有效的化療增敏藥物，逆轉肺癌細胞的耐藥性。Western blot檢測結果顯示，加入3-BrPA后的A549/DDP細胞的P-gp表達明顯降低，說明3-BrPA可下調P-gp表達，從而逆轉耐藥。同時流式細胞檢測結果顯示，3-BrPA可增強Rh123在細胞內的蓄積，并且3-BrPA濃度越大，Rh123在細胞內的蓄積量越大。由此提示，3-BrPA逆轉A549/DDP細胞耐藥性的機制可能與抑制P-gp表達、降低P-gp功能有關。

綜上所述, 本研究證實了3-BrPA在低毒劑量下確實具有抑制肺癌細胞增殖并部分逆轉肺癌細胞耐藥的作用，并初步闡明了3-BrPA逆轉耐藥的機制是通過抑制P-gp表達和降低P-gp功能而發揮逆轉作用。這為今后3-BrPA作為一種新型的腫瘤MDR逆轉劑提供了理論依據。不過因3-BrPA自身存在的安全性、穩定性、靶向性等問題決定了其克服腫瘤MDR真正進入臨床應用所需的時間。但相信隨著以上問題的逐一解決，3-BrPA可能會成為一個具有巨大應用價值的腫瘤耐藥逆轉劑。

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(本文編輯：王亞南)

唐青，胡義德. 3-BrPA對肺癌A549/DDP細胞耐藥的逆轉作用研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2016， 9(2)： 145-149.

Experimental study of 3-BrPA on reversing multidrug resistance of human lung cancer cell line A549/DDP

TangQing,HuYide.

DepartmentofOncology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,ChinaCorrespondingauthor：HuYide,Email:huyide_mit@aliyun.com

ObjectiveTo preliminarily explore the reversal effect of 3-BrPA on multidrug resistance of lung cancer cell line A549/DDP and to study its potential mechanism. Methods①Cell culture: The human lung adenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells were grown in RPMI1640 medium; ②CCK8 and Western blot were used to observe the reversal effect of 3-BrPA on cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells and the expression of P-gp. Flow cytometric technology was used to detect different concentrations of 3-BrPA on A549/DDP cells by measuring Rh123 mean fluorescence intensity (MFI). Results The IC50 of cisplatin to A549 cells, A549/DDP cells and A549/DDP cells after 3-BrPA added were 6.714 μg/ml, 38.99 μg/ml and 20.2 μg/ml, respectively. The reversal ratio was 3.03 and the relative reversal efficiency was 81% as compared to A549 cells; The 3-BrPA can make the expression of P-gp on A549/DDP cells dropped. The result of FCM shows that 3-BrPA can increase the accumulation of Rh123 on A549/DDP cells in a dose-dependent manner. Conclusions3-BrPA can reverse the drug resistance on A549/DDP cell line to cis-platinum in a certain extent, which may be attributed to down regulating of P-gp expression.

Bronchus lung cancer;3-BrPA;Cisplatin-resistant cell line A549/DDP cells;Resistance reversal

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.02.007

國家自然科學基金資助項目(81372340)

400037 重慶，第三軍醫大學新橋醫院腫瘤研究所

胡義德，Email: huyide_mit@aliyun.com

R734.2

A

2015-09-10)