過表達RhoD對人黑素瘤A375細(xì)胞骨架和遷移侵襲的影響

溫斯健 倪娜娜 周曉偉 吳瓊 王小坡 宋昊 張韡 孫建方

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（溫斯健、吳瓊、王小坡、宋昊、張韡、孫建方），江蘇省皮膚病性病分子生物學(xué)重點實驗室（倪娜娜、周曉偉）

過表達RhoD對人黑素瘤A375細(xì)胞骨架和遷移侵襲的影響

溫斯健 倪娜娜 周曉偉 吳瓊 王小坡 宋昊 張韡 孫建方

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所病理科（溫斯健、吳瓊、王小坡、宋昊、張韡、孫建方），江蘇省皮膚病性病分子生物學(xué)重點實驗室（倪娜娜、周曉偉）

目的探討RhoD對人黑素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞骨架、遷移和侵襲能力等的影響及作用機制。方法實驗分為A375?RhoD組和A375?增強型綠色熒光蛋白（EGFP）組，分別用攜帶RhoD的慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染。羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架，Transwell小室實驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，Western印跡法檢測絲切蛋白、磷酸化絲切蛋白、Diaph2和RhoD的表達。結(jié)果與A375?EGFP組細(xì)胞相比，A375?RhoD組細(xì)胞體積增大，應(yīng)力纖維變細(xì)，軟弱無力，黏著斑增多；絲狀偽足形成增加；皺褶緣和板狀偽足無明顯變化。Transwell遷移實驗顯示，A375?EGFP組和A375?RhoD組平均每200倍視野下穿膜細(xì)胞數(shù)分別為152.67±11.23和72.67±5.03，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.25，P＜0.05）。Transwell人工基底膜侵襲試驗顯示，A375?EGFP組和A375?RhoD組平均每200倍視野下穿膜細(xì)胞數(shù)分別為78.33±12.34和9.00±1，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.70，P＜ 0.05）。A375?EGFP和A375?RhoD兩組間G1期、S期和G2期細(xì)胞所占百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Western印跡結(jié)果顯示，A375?RhoD組細(xì)胞可在RhoD的刺激下激活下游信號效應(yīng)分子Diaph2，促進其表達，而A375?EGFP組未能激活，兩組間絲切蛋白和磷酸化絲切蛋白表達差異不顯著。結(jié)論RhoD過表達可能通過下游效應(yīng)分子Diaph2調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架進而抑制A375細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

黑色素瘤，實驗性；GTP磷酸水解酶類；細(xì)胞骨架；細(xì)胞遷移分析；A375細(xì)胞；RhoD

皮膚惡性黑素瘤（CMM）侵襲和轉(zhuǎn)移機制尚未完全闡明。細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞運動是黑素瘤細(xì)胞遷移和侵襲所必須的，影響細(xì)胞骨架和運動的因素必然影響黑素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［1］。RhoD是Rho家族成員之一，通過參與應(yīng)力纖維形成、黏著斑運動、細(xì)胞運動和遷移、囊泡運輸、細(xì)胞分裂等參與腫瘤細(xì)胞的侵襲過程［2］。我們設(shè)計并構(gòu)建RhoD慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人黑素瘤A375細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染前后A375細(xì)胞骨架、運動及侵襲能力等改變，分析RhoD對黑素瘤細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響，初步探索其作用的可能分子機制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

人黑素瘤A375細(xì)胞株：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院保存細(xì)胞株。慢病毒過表達RhoD載體及其陰性對照慢病毒載體［不含目的基因RhoD，含增強型綠色熒光蛋白（EGFP）］來自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。RhoD、Diaph2、絲切蛋白（cofilin）、磷酸化絲切蛋白（P?cofilin）和β肌動蛋白一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（英國Abcam公司），Transwell小室（美國Corning公司），Matrigel膠（美國BD公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物技術(shù)股份有限公司），羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（上海翊圣生物科技有限公司），化學(xué)發(fā)光液和聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司），丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma公司）。

二、細(xì)胞分組及處理

實驗分為A375?RhoD組和A375?EGFP組，分別用攜帶RhoD的慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體轉(zhuǎn)染。72 h后流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率。

三、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架

A375?EGFP和A375?RhoD細(xì)胞分別用0.25%胰酶消化，計數(shù)，以4×105個/ml接種到放有蓋玻片的6孔板中，添加培養(yǎng)基至2 ml，培養(yǎng)24 h。PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton X?100透膜10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，1 ml 2%BSA封閉2 h，加封閉液稀釋的鬼筆環(huán)肽4℃孵育過夜。純水洗3次，每次5 min。添加4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI），孵育5 min，純水洗6次，每次5 min。在載玻片上滴3～4 μl 50%甘油，將蓋玻片倒扣在上面，用封片液封住蓋玻片四周，晾干，超高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架。

四、Transwell遷移和侵襲試驗

胰酶消化并重懸，計數(shù)A375?EGFP和A375?RhoD細(xì)胞。取24孔板，加入500 μl無血清培養(yǎng)基至剛好接觸Transwell底部。取2×104細(xì)胞混合在500 μl含10%血清的培養(yǎng)基中，接種到Transwell上室中（遷移實驗和侵襲實驗的不同在于后者要事先在Transwell小室內(nèi)加制一層人工基底膜Matrigel膠），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h至細(xì)胞完全貼壁。將培養(yǎng)基去掉，Transwell上室中添加無血清培養(yǎng)基，下室添加含10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。4%多聚甲醛固定30 min，用DAPI染色10 min。純水洗滌6遍，每遍5 min。倒置熒光顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)并進行統(tǒng)計。

五、細(xì)胞周期檢測

取對數(shù)生長期A375?EGFP和A375?RhoD兩組細(xì)胞，胰蛋白酶消化、計數(shù)，按相同密度接種于直徑6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，72 h后分別收獲約1×106個細(xì)胞于離心管，258×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，冷PBS洗滌2次，棄上清，每管加預(yù)冷的75%乙醇1 ml固定，4℃過夜。PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清，加入100 μl不含DNA酶的RNA酶A，37℃水浴30 min；400 μl碘化丙啶（PI，50 g/L），4℃避光孵育 30 min。上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。實驗重復(fù)3次。

六、Western印跡檢測Diaph2、絲切蛋白、磷酸化絲切蛋白和RhoD蛋白表達

A375?EGFP和A375?RhoD兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后提取總蛋白，并用BCA蛋白測定試劑盒檢測總蛋白濃度。將等量樣品通過SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后轉(zhuǎn)膜。分別加入不同濃度一抗4℃孵育過夜，清洗后二抗室溫孵育1.5 h。β肌動蛋白作為內(nèi)參照。

圖1 超分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察A375?增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和A375?RhoD細(xì)胞微絲骨架的改變（×63） 肌動蛋白絲被羅丹明染成紅色，綠色代表轉(zhuǎn)染了攜帶EGFP的病毒顆粒，4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）將細(xì)胞核染成藍(lán)色，MERGE是前三種顏色的合成圖。與A375?EGFP組細(xì)胞相比，A375?RhoD組細(xì)胞體積增大，應(yīng)力纖維變細(xì)，黏著斑增多（如箭頭所示），絲狀偽足形成增加，皺褶緣和板狀偽足無明顯變化

七、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞A375

轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，約90%的細(xì)胞表達EGFP。流式細(xì)胞儀檢測顯示，A375?EGFP細(xì)胞EGFP表達率為97.3%，A375?RhoD細(xì)胞EGFP表達率為82.9%。

二、細(xì)胞骨架的改變

見圖1。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色后，與A375?EGFP細(xì)胞對比，A375?RhoD細(xì)胞體積增大，應(yīng)力纖維變細(xì)，軟弱無力，黏著斑增多；絲狀偽足形成增加；皺褶緣和板狀偽足無明顯變化。

三、轉(zhuǎn)染RhoD對A375細(xì)胞遷移的影響

見圖2。A375?EGFP組和A375?RhoD組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為152.67±11.23和72.67±5.03，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=62.9，P=0.00）。

四、轉(zhuǎn)染RhoD對A375細(xì)胞侵襲的影響

見圖3。A375?EGFP組和A375?RhoD組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為78.33±12.34和9.00±1.00，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.69，P=0.001）。

五、轉(zhuǎn)染RhoD對細(xì)胞周期的影響

見圖4。A375?EGFP組G1期、S期和G2期細(xì)胞百分比分別為（55.96±2.37）%、（18.93±2.37）%、（22.40±2.52）%，A375?RhoD組分別為（55.23±4.27）%、（22.70 ± 2.76）%、（20.13 ± 1.91）%，兩組各期細(xì)胞所占百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為0.26、1.79和1.24，均P＞0.05）。

圖2 熒光顯微鏡觀察A375?增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和A375?RhoD細(xì)胞遷移情況（× 200） 藍(lán)色代表4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色，綠色代表EGFP。A375?EGFP組穿膜細(xì)胞數(shù)多于A375?RhoD組

圖3 熒光顯微鏡觀察A375?增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和A375?RhoD細(xì)胞侵襲情況（× 200） 藍(lán)色代表4′，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色，綠色代表EGFP。A375?EGFP組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)多于A375?RhoD組細(xì)胞

圖4 流式細(xì)胞儀檢測A375?EGFP和A375?RhoD細(xì)胞周期變化

六、Diaph2、絲切蛋白、磷酸化絲切蛋白和RhoD蛋白表達

Western印跡法檢測顯示，轉(zhuǎn)染后A375?RhoD組RhoD表達量明顯增高，Diaph2表達升高，而絲切蛋白和磷酸化絲切蛋白在兩組中表達量差異不顯著。見圖5。

討 論

Rho蛋白是一種相對分子質(zhì)量為21 000～30 000的單體鳥核苷酸調(diào)節(jié)蛋白（G蛋白），因其具有GTP酶活性，又被稱為Rho GTP酶。Rho GTP酶屬于小G蛋白家族，目前在人類已發(fā)現(xiàn)該家族至少有20多種蛋白質(zhì)成員，分為8個亞組［3］，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和影響細(xì)胞的運動和遷移，此外還參與胞質(zhì)分裂、細(xì)胞增殖、形態(tài)發(fā)生、軸突生長等過程［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中異常表達，所介導(dǎo)的細(xì)胞運動可能在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要作用［5］。Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中異常表達，并與腫瘤進展密切相關(guān)［6］。如RhoA在睪丸癌［7］和乳腺癌［8］中表達升高并且與腫瘤進展相關(guān)；RhoC在炎癥性乳癌［9］和結(jié)直腸癌［10］中表達升高；Rac1在乳腺癌［8］和白血病［11］中表達升高；Cdc42在非小細(xì)胞肺癌［12］中表達升高；RhoB在乳腺癌［8］中表達異常升高并且與腫瘤進展相關(guān)。而另外的一些研究則發(fā)現(xiàn)，RhoB在鱗癌中表達下降［13］，在進展期肺癌則表達缺失［14］，提示RhoB可能發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

圖5 Western印跡檢測兩組A375細(xì)胞中絲切蛋白、磷酸化絲切蛋白、Diaph2和RhoD蛋白的表達

關(guān)于RhoD在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用至今尚未見報道。我們構(gòu)建慢病毒過表達RhoD載體并將其轉(zhuǎn)入人黑素瘤細(xì)胞株A375，通過熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀計算轉(zhuǎn)染效率以及Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染后RhoD的表達量，以上實驗均表明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染并高表達，可用于研究RhoD在細(xì)胞中的作用。

Transwell小室跨膜遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RhoD的A375細(xì)胞不管是跨膜運動能力還是侵襲能力均明顯下降。一項采用phagokinetic移動軌道法的研究顯示，表達顯性激活突變體RhoD/G26V后，在成纖維細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞遷移能力下降［15］。還有研究發(fā)現(xiàn)，不管趨化因子（如成纖維細(xì)胞生長因子）是否存在，過表達RhoD/G26V的內(nèi)皮細(xì)胞運動能力均明顯下降［16］。本研究結(jié)果與文獻報道相一致，RhoD可以抑制細(xì)胞的運動和侵襲能力。

RhoD對細(xì)胞遷移和侵襲的影響可能通過其對細(xì)胞骨架的影響來實現(xiàn)。RhoD對肌動蛋白系統(tǒng)的組裝有重要影響，已證實RhoD在幾株細(xì)胞系中均可以誘發(fā)外周突起形成，如BHK、HELA、NIH3T3和豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞［17?18］。細(xì)長絲狀偽足的形成總伴隨著短束狀肌動蛋白絲的組裝［18］。與傳統(tǒng)的應(yīng)力纖維由長的平行束狀的肌動蛋白絲組裝不同，RhoD 誘導(dǎo)的應(yīng)力纖維常失去極性［18?19］。組成性表達顯性激活突變體RhoD/G26V后，細(xì)胞會形成短且無序的應(yīng)力纖維，且抑制細(xì)胞的運動，這可能與黏著斑形成的減少有關(guān)［15］。結(jié)合本實驗結(jié)果和相關(guān)文獻，認(rèn)為RhoD正是通過改變細(xì)胞骨架，尤其是使黏著斑增加，進而使應(yīng)力纖維變細(xì)、無序和無力等達到抑制腫瘤細(xì)胞運動、遷移和侵襲的作用。Diaph2是RhoD特征性的下游效應(yīng)物，RhoD誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架改變需要Diaph2的共同參與［20］。Western印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RhoD使其過表達后，Diaph2亦隨之激活，其蛋白表達量上升，而絲切蛋白和磷酸化絲切蛋白表達量不變。說明RhoD正是通過Diaph2調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)力纖維和黏著斑的形成影響黑素瘤細(xì)胞遷移和侵襲。

有文獻報道［15］，轉(zhuǎn)染RhoD會誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)多核化。顯微注射顯性激活突變體RhoD（G26V）到非洲爪蟾的受精卵和胚胎中會導(dǎo)致細(xì)胞的分裂受阻并出現(xiàn)多個細(xì)胞核。這些結(jié)果提示RhoD并不影響細(xì)胞核的分裂，但是可能通過阻止收縮環(huán)（由肌動蛋白組成）的形成進一步干擾胞質(zhì)分裂。我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RhoD的細(xì)胞亦有多核形成，細(xì)胞體積明顯增大；細(xì)胞周期檢測表明，RhoD過表達對細(xì)胞周期無影響。因此，我們認(rèn)為RhoD并不影響細(xì)胞核的分裂，而是通過影響細(xì)胞骨架進而影響其胞質(zhì)分裂。

綜上所述，本次研究證明，RhoD過表達可以通過Diaph2調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)力纖維和黏著斑形成，改變細(xì)胞骨架進而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力；RhoD過表達還可能抑制胞質(zhì)分裂。這可能為黑素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的靶向治療提供一定的理論依據(jù)，RhoD有可能成為黑素瘤轉(zhuǎn)移治療的新靶點。

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Effects of RhoD overexpression on the cytoskeleton,migration and invasion of a human melanoma cell line A375

Wen Sijian,Ni Nana,Zhou Xiaowei,Wu Qiong,Wang Xiaopo,Song Hao,Zhang Wei,Sun Jianfang
Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wen SJ,Wu Q,Wang XP,Song H,Zhang W,Sun JF）;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Ni NN,Zhou XW）Corresponding author:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate effects of RhoD overexpression on the cytoskeleton,migration and invasion of a human melanoma cell line A375,and to explore their mechanisms.MethodsCultured A375 cells were divided into 2 groups to be transfected with a lentiviral vector carrying the RhoD gene（A375?RhoD group）and a negative lentiviral vector expressing enhanced green fluorescent protein（EGFP）（A375?EGFP group）respectively.After additional culture for 24 hours,rhodamine?phalloidin was used to stain cytoskeletal proteins,Transwell assay was conducted to evaluate migratory and invasive activities of cells,flow cytometry to estimate cell cycle distribution,and Western?blot analysis to measure protein expressions of cofilin,phosphorylated cofilin（p?cofilin）,Diaph2 and RhoD.ResultsCompared with the A375?EGFP group,the A375?RhoD group showed larger cells with thinner,softer and weaker stress fibers,more focal adhesions and filopodias,but no obvious changes in lamellipodias or ruffled borders.Transwell assay showed that the number of A375 cells crossing the polycarbonate membrane as well as that crossing the artificial basement membrane（matrigel）per high?power field（× 200）were significantly smaller in the A375?RhoD group than in the A375?EGFP group（migration assay:72.67±5.03vs.152.67±11.23,t=11.25,P＜0.05;invasion assay:9.00±1.00vs.78.33±12.34,t=9.70,P＜0.05）.There were no significant differences in proportions of cells in G1,S or G2 phase between the two groups（allP＞ 0.05）.Western?blot analysis showed that RhoD overexpression activated and promoted the expression of the downstream signaling protein Diaph2 in the A375?RhoD group,which was not observed in the A375?EGFP group.In addition,there were no significant differences in expressions of cofilin or p?cofilin between the two groups.ConclusionOverexpression of RhoD may regulate the cytoskeleton and suppress migratory and invasive activities of A375 cells by activating the downstream effector molecule Diaph2.

Melanoma,experimental;GTP phosphohydrolases;Cytoskeleton;Cell migration assays;A375 cells;RhoD

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.009

國家自然科學(xué)基金（81272992）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131063）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20131063）

2016?01?18）

（本文編輯：尚淑賢）