腺苷對人毛囊生長的促進作用及對血管生成素表達的影響

李艷 王淼淼 李敏 周乃慧

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚科

腺苷對人毛囊生長的促進作用及對血管生成素表達的影響

李艷 王淼淼 李敏 周乃慧

215006蘇州大學附屬第一醫院皮膚科

目的探討腺苷對人毛囊生長的促進作用及對血管生成素表達的影響。方法分離完整的人頭皮生長期毛囊，分成6組，分別加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷作用，每個濃度組再分成兩個亞組，其中一個亞組加入0.8 mg/L抗人血管生成素抗體，另外一個亞組不加抗體，顯微鏡下測量6 d內毛囊的生長長度。利用兩步酶法分離培養人毛乳頭細胞，分組同上，作用48 h后，噻唑藍法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，逆轉錄（RT）?PCR和ELISA分別檢測人毛乳頭細胞血管生成素mRNA和細胞上清液中血管生成素蛋白的表達。結果與不加腺苷的對照組相比，10～1 000 μmol/L腺苷能夠明顯促進體外培養的人毛囊生長（F=377.776，P＜0.05），其中以100 μmol/L腺苷的促進作用最為顯著（P＜0.05），加入抗人血管生成素抗體能夠部分拮抗腺苷促進人毛囊生長的作用。與對照組相比，0.1～1 000 μmol/L腺苷能夠明顯促進體外培養的人毛乳頭細胞增殖（F=230.067，P＜0.05），其中以10 μmol/L和100 μmol/L腺苷促進細胞增殖的作用最為顯著（均P＜0.05），加入抗人血管生成素抗體能夠部分拮抗腺苷促進細胞增殖的作用。流式細胞儀檢測顯示，與對照組相比，10～1 000 μmol/L腺苷能夠顯著下調毛乳頭細胞G1期細胞比例（F=75.5，P＜0.05），并顯著上調G2期（F=15.7，P＜ 0.05）和S期（F=81.8，P＜ 0.05）細胞比例。而且，與對照組相比，10 μmol/L和100 μmol/L腺苷能夠明顯促進毛乳頭細胞表達血管生成素mRNA（F=942.630，P＜0.05）和血管生成素蛋白（F=148.544，P＜0.05）。結論 腺苷在體外具有促進人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的作用，其機制可能與上調血管生成素表達有關。

腺苷；血管生成素類；毛囊；細胞增殖；細胞周期；毛乳頭細胞

腺苷是一種內源性嘌呤核苷酸，由三磷酸腺苷逐步脫磷酸化形成，具有擴張血管及減輕組織缺血性損傷等多種生物學效應。研究發現，人毛囊毛乳頭細胞和外毛根鞘細胞均能表達腺苷受體，腺苷與其受體結合后激活一系列信號轉導途徑，具有促進毛發生長的作用，其機制可能與上調血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纖維細胞生長因子7（fibroblast growth factor?7，FGF?7）的表達有關［1?2］，但確切機制尚不明確。以往研究［3?6］證實，血管生成素是一種新的毛囊起源的血管生成因子，在體內和體外均具有促進毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的作用，而腺苷能否調控毛囊及毛囊細胞中血管生成素的表達，目前尚未見報道。因此，我們探討腺苷對體外培養的人毛囊生長的作用及對血管生成素表達的影響。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

人枕部頭皮取自本院腦外科6例顱腦外傷患者手術切除的頭皮，年齡30～45歲，離體6 h以內。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。L?谷氨酰胺、分離酶、胰蛋白酶、膠原酶、胎牛血清和Williams E培養基（含2 mmol/L L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）均產自美國Gibco公司，Dulbecco Modified Eagle Media（DMEM，美國Hyclone公司），抗人血管生成素抗體和血管生成素ELISA試劑盒（美國R&D公司），Trizol Reagent（美國Invitrogen公司），TaKaRa RNA PCR試劑盒（AMV）Ver.3.0（大連TaKaRa公司），碘化丙啶（美國Molecular probe公司）。680型酶標儀（美國Bio?Rad公司），流式細胞儀FACScan（美國Becton公司）。

二、方法

1.人毛囊培養及生長測定：人毛囊分離參見文獻［7］。手術切除的標本常規消毒后，用手術刀片將真皮和皮下組織交界處分開，解剖顯微鏡下用眼科鑷拔出皮下脂肪中的毛囊，選擇完整的生長期Ⅳ期毛囊用于實驗。毛囊培養采用24孔板，每孔1個毛囊，加500 μl Williams E培養基。實驗分為6組，分別加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷，每個濃度再分成兩個亞組，一個加入終濃度為0.8 mg/L抗人血管生成素抗體，另外一個不加抗體，抗人血管生成素抗體的終濃度設定參見文獻［3］，每組8個復孔，隔天換液1次，共同培養6 d，于第0天和第6天分別在顯微鏡下測量每根毛囊的長度，兩次的差值即為該毛囊6 d內的生長長度。

2.人毛乳頭細胞培養及增殖實驗：人毛乳頭細胞培養采用兩步酶消化法，參見文獻［8?9］。分離得到純化的毛乳頭以DMEM（含15%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素）懸浮后接種于25 cm2培養瓶，2～3周后細胞大部分生長融合。取對數生長期的第3代人毛乳頭細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，待細胞貼壁后換用無血清DMEM，加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷，每個濃度再分成兩個亞組，一個加入終濃度為0.8 mg/L抗人血管生成素抗體，另外一個不加抗體，每組6個復孔。培養48 h后，每孔加噻唑藍（MTT，5 g/L）15 μl，37 ℃孵育4 h后棄去培養基，每孔加150 μl二甲基亞砜（DMSO），避光，充分振蕩混勻，酶標儀下于490 nm波長處測定吸光度值（A490）。以A490值代表細胞增殖活性。

3.細胞周期測定：取對數生長期的第3代人毛乳頭細胞，接種于25 cm2培養瓶（每瓶1.2×106個細胞），細胞貼壁后換用無血清培養基，加入腺苷，使其終濃度分別為0、0.1、1、10、100和1 000 μmol/L，每個濃度3瓶細胞。48 h后，采用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次，離心收集細胞，以75%冷乙醇固定，-20℃保存。檢測時，PBS洗滌細胞3次，加入200 μl含50 mg/L Triton的碘化丙啶，振蕩成單細胞懸液，避光，室溫靜置30 min，300目濾網過濾，流式細胞儀檢測細胞周期。

4.半定量RT?PCR檢測血管生成素mRNA的表達：取對數生長期的第3代人毛乳頭細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml的密度接種于6孔板，每孔2 ml，待細胞貼壁后換用無血清DMEM，加入0、10、100 μmol/L腺苷，培養48 h后，收集細胞上清液于10 ml離心管內，2 000×g離心5 min，以去除雜質，上清液按1次用量分裝，-20℃保存，用于下列試驗。細胞以預冷的PBS洗滌后，按TRizol試劑盒提取總RNA，將其終濃度調整為200 mg/L。按照試劑盒說明，取200 ng總RNA進行反轉錄。人血管生成素：上游引物5′?CCTGGGCGTTTTGTTGTTGG?3′，下游引物5′?TGTGGCTCGGTACTGGCATG?3′，產物大小為352 bp；人3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）：上游引物 5′?CTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC?3′，下游 引 物 5′?GCTCAGTGTAGCCCAGGATGC?3′，產物大小為220 bp。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，62℃退火10 s，72℃延伸14 s，總共30個循環，最后72℃終末延伸7 min。擴增結束后，取10 μl進行電泳檢測，并用Gene Tools軟件進行血管生成素mRNA相對表達量分析。

5.ELISA檢測血管生成素蛋白表達：取方法4中收集的細胞上清液，按ELISA試劑盒說明檢測血管生成素蛋白含量。

6.統計學分析：實驗數據以SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，結果以±s表示，采用單因素方差分析和獨立樣本的t檢驗，兩兩比較采用最小顯著差異（LSD）檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、腺苷對人毛囊生長的影響及抗人血管生成素抗體對腺苷的拮抗作用

培養6 d后，與對照組相比，10、100和1 000 μmol/L腺苷能夠顯著促進人毛囊生長（均P＜0.05），其中以100 μmol/L腺苷作用最為顯著（P＜0.05）。與不加血管生成素抗體的同一濃度腺苷組相比，加入血管生成素抗體后10、100、1 000 μmol/L腺苷組人毛囊的生長受到顯著抑制（均P＜0.05），但仍快于對照組（均P＜0.05）。見表1。

二、腺苷對人毛乳頭細胞增殖的影響

作用48h后，與對照組相比，0.1～1000μmol/L腺苷均能夠明顯促進人毛乳頭細胞增殖（均P＜0.05），其中以 10 μmol/L 和 100 μmol/L 腺苷促進細胞增殖的作用最為顯著（均P＜0.05），而10 μmol/L與100 μmol/L腺苷組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與不加血管生成素抗體的同一濃度腺苷組相比，加入血管生成素抗體后，0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷組毛乳頭細胞的增殖受到顯著抑制（P＜0.05），但仍快于對照組（均P＜0.05）。見表2。

三、腺苷對人毛乳頭細胞周期的影響

作用48 h后，與對照組相比，10、100、1 000 μmol/L腺苷組G1期細胞比例顯著降低（均P＜0.05），G2期和S期細胞比例顯著增高（均P＜0.05）。100 μmol/L腺苷組G1期細胞比例明顯低于10 μmol/L和1 000 μmol/L腺苷組（均P＜0.05），且G2期和S期細胞比例明顯高于10 μmol/L和1 000 μmol/L腺苷組（均P＜0.05），但10 μmol/L與1 000 μmol/L腺苷組相比，G1期、G2期和S期細胞比例差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表1 不同濃度腺苷作用于含或不含血管生成素抗體的毛囊6 d后毛囊生長長度比較（mm±s）

表1 不同濃度腺苷作用于含或不含血管生成素抗體的毛囊6 d后毛囊生長長度比較（mm±s）

注：n=8。a：與同一亞組對照組相比，P＜0.05；e：與同一亞組0.1 μmol/L腺苷組相比，P＜0.05；d：與同一亞組1 μmol/L腺苷組相比，P＜ 0.05；e：與同一亞組10 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；e：與同一亞組100 μmol/L腺苷組相比，P＜0.05

腺苷濃度（μmol/L）0（對照組）0.1 1 10 100 1 000 F值P值注：n=8。a：與同一亞組對照組相比，P ＜ 0.05；b：與同一亞組0.1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；c：與同一亞組1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；d：與同一亞組10 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；e：與同一亞組100 μmol/L腺苷組相比，P＜0.05血管生成素抗體不含1.23±0.04 1.25±0.04 1.26±0.03 1.49±0.02abc 1.80±0.05abcd 1.66±0.02abcde 377.776＜0.01 t值P值含1.23±0.03 1.24±0.03 1.25±0.03 1.43±0.01abc 1.53±0.02abcd 1.43±0.02abce 209.894＜0.01 0.070 0.629 0.271 8.647 13.214 23.635＞0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01表2 不同濃度腺苷作用于含或不含血管生成素抗體的毛乳頭細胞48 h后毛乳頭細胞的增殖活性比較（A490，±s）腺苷濃度（μmol/L）0（對照組）0.1 1 10 100 1 000 F值P值血管生成素抗體不含0.246±0.005 0.260±0.003a 0.269±0.003ab 0.312±0.004abc 0.314±0.007abc 0.292±0.003abcde 230.067＜0.01含0.246±0.005 0.253±0.003a 0.260±0.004ab 0.272±0.004abc 0.272±0.003abc 0.267±0.003abcde 50.165＜0.01 t值0.114 3.792 4.198 17.231 13.000 15.386 P值＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 不同濃度腺苷作用于含或不含血管生成素抗體的毛乳頭細胞48h后毛乳頭細胞的增殖活性比較（A490±s）

表2 不同濃度腺苷作用于含或不含血管生成素抗體的毛乳頭細胞48h后毛乳頭細胞的增殖活性比較（A490±s）

注：n=6。a：與同一亞組對照組相比，P ＜ 0.05；b：與同一亞組0.1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；c：與同一亞組1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；d：與同一亞組10 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；e：與同一亞組100 μmol/L腺苷組相比，P＜0.05

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四、腺苷對人毛乳頭細胞血管生成素mRNA表達的影響

見圖1。0、10、100 μmol/L腺苷作用人毛乳頭細胞48 h后，血管生成素mRNA的相對表達量分別為0.346±0.014、0.594±0.009和0.755±0.012。與對照組相比，10、100 μmol/L腺苷能夠明顯促進人毛乳頭細胞表達血管生成素mRNA（F=942.630，P＜0.05），且100 μmol/L腺苷組血管生成素mRNA相對表達量明顯高于10 μmol/L腺苷組（P＜0.05）。

表3 不同濃度腺苷作用48 h后毛乳頭細胞細胞周期分布（±s）

表3 不同濃度腺苷作用48 h后毛乳頭細胞細胞周期分布（±s）

注：n=3。a：與對照組相比，P ＜ 0.05；b：與0.1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；c：與1 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；d：與10 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05；e：與100 μmol/L腺苷組相比，P ＜ 0.05

腺苷濃度（μmol/L）0（對照組）0.1 1 10 100 1 000 F值P值細胞周期（%）G1 94.73±0.64 93.66±0.77 93.39±0.22 88.41±1.06abc 84.63±0.73abcd 88.57±1.03abce 75.5＜0.01 G2 2.83±0.51 2.99±0.60 3.19±0.24 4.25±0.28abc 5.89±0.86abcd 4.18±0.17abce 15.7＜0.01 S 1.46±0.15 2.32±0.19 2.30±0.22 6.93±1.06abc 8.71±0.33abcd 6.69±0.86abce 81.8＜0.01

圖1 不同濃度腺苷對人毛乳頭細胞血管生成素mRNA表達的影響 M：標準參照物；1～3：分別示0、10和100 μmol/L腺苷組血管生成素的表達；4～6：分別示0、10和100 μmol/L腺苷組3磷酸甘油醛脫氫酶的表達

五、腺苷對人毛乳頭細胞上清液中血管生成素蛋白表達的影響

ELISA檢測顯示，10和100 μmol/L腺苷組細胞上清液中血管生成素蛋白的濃度分別為（251.484±9.869）ng/L和（278.296± 4.249）ng/L，明顯高于對照組［（185.20 ± 4.869）ng/L，F=148.544，P＜0.05］，且100 μmol/L腺苷組明顯高于10 μmol/L腺苷組（P＜0.05）。

討 論

毛囊最為顯著的特點是始終處于生長期、退行期和休止期的周期性循環中。在毛囊的形態學發生和周期性循環中，許多激素、生長因子、細胞因子及其受體等相互作用，共同調控毛發的生長與脫落［10］。腺苷作為一種內源性嘌呤核苷酸，在體內具有擴張血管、保護組織缺血性損傷等多種生物學效應，以往的研究發現，腺苷具有促進毛發生長的作用，其機理可能與上調VEGF和FGF?7的表達有關［1?2］。血管生成素是一種新的具有促進毛發生長的血管生成因子，到目前為止尚不明確腺苷是否能夠調控毛囊及毛囊細胞中血管生成素的表達。

本研究顯示，10～1 000 μmol/L腺苷能夠明顯促進人毛囊生長，其中以100 μmol/L腺苷作用最為顯著；0.1～1 000 μmol/L腺苷能夠明顯促進體外培養的人毛乳頭細胞增殖，其中以10 μmol/L和100 μmol/L腺苷作用最為顯著。流式細胞儀檢測發現，10～1 000 μmol/L腺苷能夠明顯促進毛乳頭細胞由G1期進入G2期和S期，從而發揮促進細胞增殖的作用。提示腺苷在體外具有促進人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的作用。鑒于毛乳頭細胞在毛囊的生長發育及周期性循環中起關鍵作用，毛乳頭細胞的數量在一定程度上決定了毛囊的直徑及毛發的粗細［11］，因此腺苷在體外促進人毛囊生長可能與其促進毛乳頭細胞增殖有關。

為進一步探討腺苷促進毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的可能作用機制，我們在不同濃度腺苷作用的毛囊和毛乳頭細胞中同時加入抗人血管生成素抗體，結果顯示，抗人血管生成素抗體能夠部分拮抗腺苷對人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的促進作用，半定量RT?PCR和ELISA檢測結果發現，腺苷能夠上調人毛乳頭細胞表達血管生成素mRNA和蛋白。由此可見，腺苷在體外具有促進人毛囊生長的作用，其機制可能與促進毛乳頭細胞增殖有關，腺苷誘導表達的血管生成素部分參與腺苷促進人毛囊生長和毛乳頭細胞增殖的作用。但是，腺苷在體內是否同樣具有促進毛發生長的作用及其如何調控血管生成素的表達仍有待進一步深入研究。

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Promotive effects of adenosine on human hair follicle growth and angiogenin expression

Li Yan,Wang Miaomiao,Li Min,Zhou Naihui
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China Corresponding author:Zhou Naihui,Email:zhounaihui@163.com

ObjectiveTo evaluate the promotive effects of adenosine on human hair follicle growth and angiogenin expression.MethodsIntact human hair follicles in the anagen phase were isolated from the scalp,and then divided into 6 groups to be treated with adenosine at different concentrations of 0,0.1,1,10,100 and 1 000 μmol/L respectively.Each adenosine group was further divided into 2 subgroups to be treated either with or without 0.8 mg/L anti?human angiogenin antibody,and hair follicles receiving no treatment served as the control group.The growth length of hair follicles during 6?day culture was measured by using a microscope.Human dermal papilla cells were isolated by a two?step enzyme digestion method,and then classified into the same groups as above.After 48?hour culture,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,flow cytometry to analyze cell cycle,reverse transcription（RT）?PCR to measure the mRNA expression of angiogenin in dermal papilla cells,and enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）to measure the protein expression of angiogenin in the culture supernatant of dermal papilla cells.ResultsCompared with the control group,the 10-1 000 μmol/L adenosine?treated groups showed significantly increased growth of hair folliclesin vitro（F=377.776,P＜ 0.05）,and 100 μmol/L adenosine had the strongest promotive effect（P＜ 0.05）.However,anti?human angiogenin antibody could partly antagonize the promotive effect.Compared with the control group,the proliferative activity of human dermal papilla cells was significantly enhanced in the 0.1-1 000 μmol/L adenosine?treated groups（F=230.067,P＜ 0.05）,and adenosine at 10 and 100 μmol/L had the strongest enhancing effects（bothP＜ 0.05）.Similarly,anti?human angiogenin antibody could partly antagonize the enhancing effects of adenosine on cell proliferation.As flow cytometry showed,compared with the control group,the 10-1 000 μmol/L adenosine?treated groups showed significantly lower proportions of dermal papilla cells in G1 phase（F=75.5,P＜ 0.05）,but higher proportions of cells in G2 phase（F=15.7,P＜ 0.05）and S phase（F=81.8,P＜ 0.05）.In addition,the mRNA and protein expressions of angiogenin were significantly up?regulated in human dermal papilla cells treated by 10 and 100 μmol/L adenosine compared with the control group（F=942.630,148.544,respectively,bothP＜ 0.05）.ConclusionAdenosine can promote the growth of human hair follicles and proliferation of dermal papilla cells,likely by up?regulating angiogenin expression.

Adenosine;Angiogenins;Hair follicle;Cell proliferation;Cell cycle;Dermal papilla cells

周乃慧，Email：zhounaihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.003

江蘇省自然科學基金（BK20140294、BK20130267）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140294,BK20130267）

2016?03?14）

（本文編輯：尚淑賢）