液相色譜-串聯質譜法檢測黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量

王興進

(寧德市產品質量檢驗所， 寧德 352100)

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液相色譜-串聯質譜法檢測黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量

王興進

(寧德市產品質量檢驗所， 寧德 352100)

樣品在酸性條件下通過加入鄰硝基苯甲醛實現衍生化，乙酸乙酯萃取，濃縮，以乙腈∶水(20∶80)定容和正己烷除脂后，采用液相色譜-串聯質譜法檢測黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量。該方法中4種硝基呋喃代謝物在1～50μg/L濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數均大于0.9971，定量限均為0.5μg/kg。4個添加水平(1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)的平均回收率在89.3%～106%之間，相對偏差均小于7.03%。結果表明該方法滿足黃魚鲞中硝基呋喃代謝物的檢測要求。

液相色譜-串聯質譜法硝基呋喃代謝物黃魚鲞

大黃魚作為我國傳統的食用魚類，具有獨特競爭優勢，是我國八大優勢出口養殖水產品品種之一。近年來由于活魚運輸困難以及大黃魚制品(如黃魚鲞等)等相對口味較好，加上傳統飲食習慣以及產業發展的需求，現在黃魚鲞等產品的銷量不斷增加。但是養殖過程中魚藥乃至禁藥的濫用，導致了養殖海域的連片污染，嚴重影響了大黃魚的質量安全，直接影響了大黃魚及其制品(如黃魚鲞等)的出口。

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的具有廣效性的抗菌藥物，目前較為廣泛使用的硝基呋喃類藥物有：:呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)、呋喃西林(NFZ)和呋喃妥因(NFT), 其對應的代謝物分別為:3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-內酰脲(A HD)。因這類藥物價格低廉且療效性強，因此常被用于畜禽及水產的養殖過程。當人類攝入了含有硝基呋喃類藥物殘留的食品后，代謝物在胃液的酸性條件下從蛋白質中釋放出來被人體吸收，從而對人體造成一定的傷害，長期食入此類食品會對人體產生慢性毒性和致突變致癌的危險[1-4]。因此，世界各國均嚴禁在治療和飼料中使用，美國FDA于2002年禁止了硝基呋喃類藥物在食品動物中的使用，歐盟和日本也同樣禁止在食品動物中使用，我國農業部也于2002年發布了第193號公告，將硝基呋喃類抗菌劑列入了《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，明確禁止了硝基呋喃類藥物在食用動物中的使用。

目前，硝基呋喃代謝產物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-6]、酶聯免疫法(ELISA)[3,4]、液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[4,7]以及液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[2,4,8，9]檢測。其中ELISA法一般用于藥物殘留的定性分析，實現藥物殘留的初步篩查，無法滿足定量要求，而高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質譜法(HPLC-MS)方法的靈敏度和選擇性都較液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)差，無法滿足歐盟EEC/657/2002標準和日本、美國等發達國家對我國出口動物源性食品檢測要求。關于硝基呋喃代謝物的測定研究報道大多限于禽獸肉、鮮水產品等的檢測[7-10]，對于黃魚鲞中硝基呋喃代謝物檢測的報道相對較少。本實驗在酸性條件下通過加入2-硝基苯甲醛實現衍生化，乙酸乙酯兩次萃取，正己烷除脂，液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)檢測，同位素標記內標法定量，實現了對黃魚鲞中硝基呋喃代謝物的檢測分析。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑1.1.1儀器設備

液相色譜-串聯質譜儀(Aglient 1290-6460)：配帶Jet Stream的電噴霧離子源(ESI)；高速組織搗碎機(德國IKA公司)；旋轉濃縮儀(上海亞榮)；Milli-Q超純水設備(美國Millipore公司)；漩渦混合器(德國IKA公司)；，恒溫振蕩器(常州國華)；低溫高速離心機(德國Sigma公司)；微孔濾膜為0.2μm。

1.1.2試劑與材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純；甲酸：≥99%；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀(均為分析純)；鄰硝基苯甲醛：≥99%，鄰硝基苯甲醛溶液用乙腈溶解，現用現配；配制溶液的水為超純水。

標準品儲備液均用甲醇配制，-18℃避光保存(有效期6個月)；工作液用時用儲備液稀釋，現配現用。

1.2樣品前處理

準確稱取2g(精確至0.01g)試樣于50mL塑料離心管中，加入10mL 甲醇-水混合溶液(1+1，V+V)，超聲5 min后，5000r/min離心，棄去上清液。殘留物中加入10mL 的0.2mol/L鹽酸溶液，均質1min，再用5mL鹽酸溶液洗滌均質器刀，合并鹽酸溶液，再加入0.2 mL的0.01mg/L的混合內標標準溶液，0.1 mL的0.1mol/L的鄰硝基苯甲醛溶液，漩渦混勻器混勻，置于37℃恒溫箱中避光反應16h。

取出衍生液，冷卻至室溫后，加入1.5mL0.3mol/L磷酸鉀溶液，用1.0mol/L氫氧化鈉調節pH至7.4左右，加入15mL乙酸乙酯渦旋混合1min后，渦旋提取1min后，離心，收集乙酸乙酯層。殘留物再加入15mL乙酸乙酯，超聲萃取10min，合并兩次的提取液，于40℃下氮氣吹干。用1.00mL乙腈∶水(20∶80)溶液定容，再加入3mL乙腈飽和的正己烷去除脂肪，下層水相過0.2μm濾膜供液相色譜-串聯質譜測定[11]。

1.3儀器條件1.3.1質譜條件

離子源：帶鞘氣電噴霧離子源(ESI)；毛細管電壓：4.00kV；離子源溫度：110℃；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：8L/min；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：12L/min；碰撞氣：氮氣；多反應監測掃描模式(MRM),其它質譜參數見表1。

1.3.2色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus(2.1mm×50mm，1.8μm)；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進樣量：10μL；流動相：溶劑A為0.1%甲酸水，溶劑B為乙腈，流動性梯度洗脫程序見表2。

表1　硝基呋喃代謝物及其內標物的質譜參數

表2　液相色譜梯度洗脫程序

2　結果與討論

2.1質譜條件的優化

硝基呋喃4種代謝物(AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD)分子結構中均含有氨基，在電離情況下容易獲取正電荷，因此選擇正離子模式進行掃描。在正離子檢測方式下，先對各化合物進行全掃描，以確定四個化合物的母離子，再采用子離子掃描，得到碎片離子信息和二級質譜圖。同時對碎裂電壓和碰撞能量進行優化，使得母離子和特征子離子強度達到最大，確定的最佳質譜參數見表1。

由于基質效應的影響，在采用液相色譜-串聯質譜法檢測時，目標化合物會發生離子增強或抑制的作用。因此，本方法通過添加內標的方式來減弱離子化時的基質效應，分別采用D5-AMOZ、13C3-AHD、13C15N2-SEM、 D4-AOZ作為內標定量，從而使定量結果更加準確。

2.2色譜條件的優化

比較了兩種不同流動相乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對目標物的分離度和靈敏度的影響，實驗結果表明，乙腈-0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫時，4種代謝物的衍生物可得到較好的分離和響應。確定的最佳的色譜參數見表2。

2.3方法驗證2.3.1標準曲線及檢出限

在確定的色譜和質譜條件下， 4 種硝基呋喃代謝物在 1.0 ng/mL～ 50 ng/mL(內標物濃度為4ng/mL)范圍內線性良好，相關系數均大于0.9971，見表3。以3倍信噪比(S/N)計算4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.2 μg/kg，以10倍信噪比確定其定量限為0.5μg/kg。4種硝基呋喃代謝物衍生物的MRM譜圖見圖1。

表3　種硝基呋喃代謝物的線性方程與相關系數

2.3.2回收率及精密度

選取咸香大黃魚和醉香大黃魚兩種黃魚鲞進行回收率及精密度實驗，準確稱取空白黃魚鲞樣品2.00g，分別添加1μ g/kg、2μ g/kg、5μ g/kg及10μ g/kg 4個濃度的硝基呋喃代謝物混合標準溶液及2μ g/kg的內標混合標準溶液，其中不同添加量的重復樣品數為6。按照本實驗建立的方法測定添加樣品中硝基呋喃類代謝物的殘留量。計算平均回收率和相對偏差,結果見表4。從表4中可以看出，4種硝基呋喃代謝產物的平均回收率在89.3%～106%之間，相對標準偏差RSD均小于7.1 %。表明該方法完全滿足硝基呋喃類藥物的檢測要求。

表4　4種硝基呋喃代謝物的平均回收率和相對標準偏差(n=6)

2.4實際樣品檢測

采用已建立的方法對市場上采集的60份黃魚鲞樣品進行硝基呋喃代謝物殘留量的檢測分析，結果表明， 57份硝基呋喃代謝物均未檢出，3份樣品檢出SEM，但是檢出值均小于定量限(0.5μg/kg)。

3　結論

研究了采用高效液相色譜串聯質譜法檢測黃魚鲞中的硝基呋喃代謝物產物的殘留量，并進行了方法學評價，結果表明該方法的回收率為89.3%～106%，相對標準偏差均小于7.1% ，檢出限均為0.5μg/kg。本方法可有效用于黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留的檢測。

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Determination of nitrofuran metabolites residues in dried salted yellow croakers by HPLC-MS/MS.

Wang Xingjin

(NingdeQualityInspectionInstituteofProduct,Ningde352100,China)

The samples were derived with 2-nitrobenzaldehyde in hydrochloric acid solution. After extracted with ethyl acetate and concentrated with rotary evaporator,the analytes were dissolved with acetonitrile solution (CH3CN:H2O=20:80), defatted with n-hexane and determined by LC-MS/MS. The results showed that the calibration curves for the analytes exhibited good linearity over the concentration range from 1 to 50 μg/L with the LOQ of 0.5μg/kg . Average recoveries for the spiked samples at 4 levels (1μg/kg, 2μg/kg, 5μg/kg, 10μg/kg) ranged from 89.3% to 106%, with a RSD less than 7.03%. The method is suitable for the determination of nitrofurans metabolites in dried salted yellow croakers.

HPLC-MS/MS; nitrofuran metabolites;dried salted yellow croakers

福建省質量技術監督局科技項目(FJQI2013112)

王興進，男，1970年出生，學士，高級工程師，主要從事食品質量控制和衛生檢測，E-mail: quikenter@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.004

2016-05-14