紫色辣椒葉片花青素的純化及其生物活性分析

胡能兵，隋益虎，林　毅

(1.安徽科技學院 農學院，安徽 鳳陽 233100；2.安徽農業大學 生命科學學院，安徽 合肥 230031)

?

紫色辣椒葉片花青素的純化及其生物活性分析

胡能兵1，隋益虎1，林毅2

(1.安徽科技學院 農學院，安徽 鳳陽 233100；2.安徽農業大學 生命科學學院，安徽 合肥 230031)

大孔樹脂；紫色辣椒；抗氧化；生物活性

花色苷具有清除自由基的功效，主要通過提供氫原子與自由基作用，終止鏈式反應的傳遞，進而干擾新自由基的增殖，但原料來源和加工工藝的不同會導致其清除自由基的能力有所差異。發酵法提取的紫甘薯色素PSPPs2比常規法提取的PSPPs1和BHT高，尤其是在低濃度(0.2 mg·mL-1)時，其清除DPPH自由基的能力達到92.77%[1]。此外，花色苷還具有抑菌能力。楊梅花色苷提取物對灰霉葡萄孢的抑制能力隨濃度增加而提高，濃度為10%時，抑菌率達到29.28%[2]。野生毛葡萄花青素提取物對細菌有較強的抑制作用，隨著濃度升高和作用時間的增加，抑菌率升高；但對真菌抑菌效果不明顯，尤其是對煙曲霉無作用[3]。

紫色辣椒(Capsicum annuum L)是稀有的辣椒種質資源[4]。本試驗擬以提取、濃縮后的紫色辣椒7036的葉片花青素為材料，研究其純化工藝及影響因素，并對其精制品進行抗氧化和抑菌功能研究，探明其抗氧化和抑菌特性，為其在食品、藥品以及化妝品行業的應用提供依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

紫色辣椒7036系安徽科技學院辣椒課題組提供。在辣椒營養生長期，取其濃紫色葉片，經液氮研磨，提取葉片花青素，濃縮，用于后續的大孔樹脂純化及凍干，之后獲得葉片花青素精制品。

1.2試驗方法

1.2.1大孔樹脂吸附葉片花青素的正交設計

前期預備試驗表明，HPD-100是最適宜紫色辣椒葉片花青素吸附的大孔樹脂。設置pH(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)、溫度、固液比(固體為樹脂質量，液體為10 mL濃縮液與40 mL pH緩沖液的混合液)、轉速為考查因子，因素水平設計參照文獻[5-7]并略作調整，按L16(45)正交表設計進行試驗，以吸附前后溶液的吸光度(542 nm)差值為指標(表1)。每處理重復3次，運用DPS軟件對上述結果進行極差、方差分析。

表1正交實驗設計

Table 1Orthogonal test design

水平A∶pHB:溫度/℃C:固液比D:轉速(r·min-1)13201∶5010024302∶5015035403∶5020046504∶50250

1.2.2葉片花青素解吸附

準確稱取已經吸附紫色辣椒葉片花青素的樹脂各2 g，分別加入0，20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液50 mL，置于搖床中震蕩1 h，測定各溶液的吸光度。

1.2.3葉片花青素精制品制備

將解吸附后的液體經過減壓、真空濃縮及濃縮液凍干后，獲得粉末狀精制品，精制品保存于-20℃條件下，用于后續試驗。

1.2.4抗氧化性能測定

1.2.5抑菌性能測定

精制品溶液的制備：將粉末狀的紫色辣椒葉片色素精制品用25%的乙醇分別稀釋至10，5，2.5，1.25 mg·mL-1，分別經過0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后，保存待用。

培養基平板制備：大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平板，根霉和黑曲霉用馬鈴薯瓊脂培養基平板。用無菌水將上述各菌的孢子配制成106～107的懸液，無菌吸取0.2 mL的各菌液涂布至上述平板上。

抑菌試驗：采用濾紙片和牛津杯法。濾紙片法：取直徑為1 mm的濾紙片，滅菌后浸于過濾除菌含不同濃度的紫色辣椒葉片花青素精制品的液體中1 min，分別鋪在接種有大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等細菌和真菌的培養基上。牛津杯法：將滅菌后的外徑8 mm、內徑6 mm的牛津杯置于平板表面，吸取上述濃度的紫色辣椒葉片花青素精制品溶液0.2 mL至牛津杯中，盡量不要將菌液溢出牛津杯外。用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。

2　結果與分析

2.1各因素對大孔樹脂吸附紫色辣椒葉片花青素的影響

由表2的極差分析結果可知，影響大孔樹脂HPD-100吸附紫色辣椒葉片花青素的各因素依次為：A(pH)>C(固液比)>B(溫度)>D(轉速)。從各因素來看，理論上達到最大的組合應為A4B3C2D2。方差分析結果顯示，在不同pH、溫度、固液比和轉速條件下，以HPD-100為樹脂開展純化，pH、溫度和固液比的不同水平間差異達到極顯著水平，而轉速各水平間無顯著差異。從表2可以看出，在所試驗的各排列組合中，最優組合為A4B3C2D4。考慮到理論最優組合與試驗最優組合僅有轉速上的差異，而轉速對試驗結果無顯著影響，因此，用HPD-100樹脂吸附紫色辣椒葉片花青素的最優組合為A4B3C2D4。

表2HPD-100大孔樹脂吸附紫色辣椒葉片花青素的正交實驗結果

Table 2Result of orthogonal design of purification of anthocyanin from purple pepper leaf by HPD-100

編號ABCD吸光度差值111110.957212221.070313331.067414441.085521231.143622141.042723411.192824321.198931341.2081032431.2091133121.2071234211.3101341421.2591442311.2401543241.3311644131.173K14.1794.5674.3794.699 K24.5754.5614.8544.734K34.9344.7974.7134.592K45.0034.7664.7454.666k11.0451.1421.0951.175 k21.1441.1401.2141.184k31.2341.1991.1781.148k41.2511.1921.1861.167極差R0.2060.0590.1190.036

2.2紫色辣椒葉片花青素的解吸附

乙醇溶液濃度的差異，會導致其極性有所不同，進而影響葉片花青素與大孔樹脂的分子間作用力；此外，不同乙醇濃度也會影響葉片花青素在乙醇中的溶解度。本試驗選擇了0，20%，40%，60%，80%和100%等6種不同濃度的乙醇，分別對濕重為2 g、充分吸附紫色辣椒葉片花青素的樹脂進行解吸附(圖1)。當乙醇濃度為100%時，樹脂解吸附后溶液的最大吸光度為1.248；當乙醇濃度在0～80%之間時，隨著乙醇濃度的上升，吸光度呈現先升后降的趨勢，在40%乙醇條件下，解吸附樹脂HPD-100后溶液的吸光度最大，為0.774。由于乙醇濃度過高會不利于凍干和粉狀精制品的獲得，故選擇40%的乙醇作為解吸附最適乙醇濃度。

2.3紫色辣椒葉片花青素抗氧化性能

2.4紫色辣椒葉片花青素抑菌性能

采用濾紙法分別比較了紫色辣椒葉片花青素精制品對4種細菌和2種真菌的抑菌效果，結果見表3。當紫色辣椒葉片花青素精制品濃度為5 mg·mL-1時，對真菌(根霉、黑曲霉)和細菌都沒有抑菌效果。在高濃度條件下，即當精制品濃度為10 mg·mL-1時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌有一定的抑菌效果，通過抑菌圈直徑可知，其對上述細菌的抑菌效果依次為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>地衣芽孢桿菌。

運用牛津杯法比較了紫色辣椒葉片花青素精制品對4種細菌和2種真菌的抑菌效果，結果見表3。當紫色辣椒葉片花青素精制品濃度為5 mg·mL-1時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌就表現出了抑菌作用，但對真菌(根霉、黑曲霉)沒有抑菌效果。由抑菌圈直徑可知，其對上述細菌的抑菌效果依次為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌=地衣芽孢桿菌。當紫色辣椒葉片花青素精制品濃度提高到10 mg·mL-1時，其抑菌效果與5 mg·mL-1時略有不同，對4種細菌均表現出明顯的抑菌作用。由抑菌圈直徑可知，高濃度花青素精制品對4種細菌的抑菌效果依次為：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>地衣芽孢桿菌>蘇云金芽孢桿菌。

圖1　乙醇濃度對HPD-100樹脂解吸附的影響Fig.1　Influence of ethanol concentration on desorption of HPD-100

圖2　紫色辣椒葉片色素精制品對羥自由基(·OH)、超氧陰離子·)及DPPH的清除效果Fig.2　Elimination effect of purple pepper leaf anthocyanin on ·OH(A)，superoxide anion(B) and DPPH(C)

表3紫色辣椒葉片花青素精制品對菌種的抑制作用(mm)

Table 3Antimicrobial effect of different concentrations of purple pepper leaf anthocyanin (mm)

試驗方法濃度/(mg·mL-1)大腸桿菌金黃色葡萄球菌地衣芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌根霉黑曲霉濾紙法5——————108.377.637.20———牛津杯法511.010.510.5———1016.517.514.512.5——

3　討論

關于花色苷、花青素的抗氧化性能，目前已有較多報道，其在減緩或治療心血管疾病、血液循環障礙等方面具有實際意義。然而，國內關于花青素等物質在抑菌方面的報道較少，僅限于紫甘薯、山楂、葡萄籽等少量植物[9-17]。甘薯是花青素的主要來源，王關林等[15]以甘薯塊根花青素(SPAC)為原料，發現其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌都有不同程度的抑制作用，尤以金黃色葡萄球菌對SPAC的敏感性最強。其機理可能為：花青素的分子結構含有較多的酚羥基，可與蛋白質或酶通過氫鍵結合，引起菌體嚴重的質壁分離、細胞質固縮，并解體成空泡，從而導致細胞死亡。

此前，尚未有紫色辣椒葉片花青素精制品制備及其生物活性的研究報道。本試驗研究表明，紫色辣椒葉片可作為花青素的新來源，影響大孔樹脂HPD-100吸附紫色辣椒葉片花青素的因素大小順序為：A(pH)>C(固液比)>B(溫度)>D(轉速)，40%乙醇可作為解吸附的最適乙醇濃度。對花青素精制品的分析表明，其具有一定的抗氧化能力，尤其是對羥自由基(·OH)的清除效果要優于Vc。考慮到本試驗中所采用的花青素精制品在制備過程中涉及諸多的高溫環節，對花青素有一定的破壞作用，可能導致花青素含量的損失，影響花青素的抗氧化性能，因此，運用新技術減少高溫環節或縮短高溫處理時間，有望極大提升紫色辣椒葉片花青素的商品價值。

食品工業中，以細菌、霉菌和酵母菌等為代表的微生物常常會導致食品敗壞，而化學防腐劑大都具有一定的毒性，長期或過量使用會極大損害人體的健康。將天然產物，如花色苷等用于食品保存，或將天然產物與現有防腐劑復配，既可減少防腐劑的用量，又會賦予食品特有的營養保健功能，具有很高的開發潛能。本研究的抗菌試驗表明，紫色辣椒葉片花青素對細菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等都有一定的抑制效果，對真菌無抑制作用。而申杰[2]研究認為，楊梅花色苷對灰霉葡萄孢有抑制效果。這種差異可能與花青素的來源和類型有關。

[1]韓永斌.紫甘薯花色苷提取工藝與組分分析及其穩定性和抗氧化性研究[D].南京:南京農業大學，2007.

[2]申杰.楊梅落果花色苷的提取、純化及其抑菌活性研究[D].南京:南京農業大學，2010.

[3]涂佳.野生毛葡萄中原花青素提取純化及抗菌研究[D].長沙:中南林業科技大學，2010.

[4]隋益虎，錢春桃，陳勁楓，等.紫色辣椒夏季坐果率及其主要光合特性分析[J].園藝學報，2011，38(1):77-86.

[5]李進.黑果枸杞色素研究[D].上海:華東師范大學，2006.

[6]李穎暢.藍莓花色苷提取純化及生理功能研究[D].沈陽:沈陽農業大學，2008.

[7]王鋒.黑花生衣色素的研究[D].長沙:湖南農業大學，2007.

[8]沈德艷，郁建平，張訓海，等.寶塔菜功能性低聚糖體外抗氧化活性及其對體外培養小鼠T淋巴細胞增殖能力的影響[J].食品科學，2013 (19):321-325.

[9]胡金奎.桑葚花色苷的分離制備、結構分析及其體外活性[D].無錫:江南大學，2013.

[10]陳建楊.特色馬鈴薯花色苷體外抗癌活性研究[D].杭州:浙江大學，2013.

[11]侯方麗.黑米花色苷對CCl4誘導小鼠肝損傷的保護作用及其抗氧化機制[D].武漢:華中農業大學，2009.

[12]陳恒恒，馮希平.根面齲研究進展[J].廣東牙病防治，2009，17(12):612-614.

[13]畢玲.葡萄籽原花青素提取物預防齲病的實驗研究[D].杭州:浙江大學，2008.

[14]張玲玲.葡萄籽原花青素對黏性放線菌影響的實驗研究[D].鄭州:鄭州大學，2010.

[15]王關林，岳靜，李洪艷，等.甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析[J].中國農業科學，2005，38(11):2321-2326.

[16]張瑞巧.山楂果肉原花青素的分離、鑒定與生物活性研究[D].武漢:華中農業大學，2007.

[17]李丹丹.響應面法優化紫薯花色苷與防腐劑復配抑菌作用研究[D].南昌:南昌大學，2013.

(責任編輯高峻)

Purification of anthocyanin from purple pepper leaf and its bio-activities

HU Neng-bing1，SUI Yi-hu1，LIN Yi2

(1.College of Agriculture，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;2.College of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230031，China)

macroporous resin;purple pepper;anti-oxidation;bio-activities

浙江農業學報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):452-456http://www.zjnyxb.cn

胡能兵，隋益虎，林毅.紫色辣椒葉片花青素的純化及其生物活性分析 [J].浙江農業學報，2016，28(3)： 452-456.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.15

2015-06-25

安徽省教育廳重點項目(KJ2014A057)；國家星火計劃(2012GA710028)；安徽科技學院自然科學項目(ZRC2013374)

胡能兵(1980—)，男，安徽東至人，博士，副教授，從事園藝植物組織培養及育種工作。E-mail∶hunengbing@126.com

S63

A

1004-1524(2016)03-0452-05