紅景天苷對宮頸癌Siha細胞增殖及IMP3表達的影響*

高　瑾，羅　偉，王　欽，徐偉翔，吳岢蔚，李　杰，章麗霞△

(1.蘭州石化總醫院婦產科,蘭州 730060；2.川北醫學院法醫學系，四川南充 637000)

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·經驗交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.036

紅景天苷對宮頸癌Siha細胞增殖及IMP3表達的影響*

高瑾1，羅偉2，王欽2，徐偉翔2，吳岢蔚2，李杰2，章麗霞2△

(1.蘭州石化總醫院婦產科,蘭州 730060；2.川北醫學院法醫學系，四川南充 637000)

目的檢測紅景天苷對宮頸癌Siha細胞中胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA 結合蛋白3(IMP3)表達情況的影響及其意義。方法采用CCK-8法檢測不同濃度紅景天苷作用Siha細胞24、48、72 h的細胞增殖抑制作用，采用Western blot和RT-PCR檢測宮頸癌Siha細胞中IMP3的蛋白和mRNA的表達水平。結果紅景天苷對宮頸癌Siha細胞的增殖抑制率具有時間和濃度雙重依賴性(P<0.05)。IMP3在紅景天苷組宮頸癌Siha細胞中的蛋白和mRNA表達均低于對照組(P<0.05)。結論紅景天苷可抑制宮頸癌Siha細胞增殖，同時降低Siha細胞IMP3的表達。

紅景天屬；宮頸腫瘤；Siha細胞；胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結合蛋白

紅景天是一種具有廣泛藥理作用的天然中草藥植物，其主要有效成分是紅景天苷。紅景天苷對體外培養人胃腺癌細胞系SGC-7901細胞[1]、人乳腺癌MCF-7細胞[2]及肺腺癌SPC-A-1細胞[3]等有一定的抑制作用；動物實驗研究也有報道，紅景天苷具有抑制體內移植瘤如小鼠腹水型H22肝癌[4]和Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長、提高小鼠生存期的作用[5]。目前尚少見對紅景天苷作用宮頸癌Siha細胞后檢測其胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA 結合蛋白3(IMP3)表達的報道。本研究通過不同濃度紅景天分別作用宮頸癌Siha細胞24、48、72 h，觀察紅景天苷對宮頸癌Siha細胞增殖抑制作用，從而選取紅景天苷作用宮頸癌Siha細胞的最佳干預濃度，檢測并分析紅景天苷作用宮頸癌Siha細胞后，細胞中IMP3的表達變化，為紅景天苷應用于臨床治療宮頸癌進行初步研究。

1　材料與方法

1.1材料人宮頸鱗癌Siha細胞由川北醫學院影像研究所惠贈，IMP3單克隆抗體購于ABCAM 公司(ab177477)，CCK-8試劑，增強型RIPA裂解液，苯甲基磺酰氟(PMSF)，超敏ECL化學發光即用型底物，二抗，CCK-8試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；新生牛血清購于TBD 公司；高糖DMEM購于Gibco公司。紅景天苷購于上海源葉生物科技有限公司，純度：HHPLC=98%，規格：每支20 mg。

1.2方法

1.2.1細胞培養用DMEM 培養液(含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/mL)在37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。每2～3天換液1 次，取對數生長期細胞備用。

1.2.2CCK-8法檢測紅景天苷Siha細胞的毒性作用取對數生長期的宮頸癌Siha細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h后，棄去原培養基，紅景天苷處理組加入用含10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋的0、20、40、80、160、320 μg/mL的紅景天苷；對照組加含10%胎牛血清的DMEM培養液100 μL培養細胞，空白對照組不加細胞僅加含10%胎牛血清的DMEM培養液100 μL，每組6個復孔繼續分別培養至24、48、72 h后每孔分別加入10 μL CCK-8，置37 ℃，5% CO2培養箱中孵育3 h后，在酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光度值(A)，抑制率(%)=1-(實驗組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.2.3Western blot法取對數生長期的宮頸癌Siha細胞，經胰酶消化后調整細胞密度為每毫升1×106個，接種于培養瓶中，每瓶4 mL。待細胞培養至對數期時吸棄舊液，PBS溶液洗滌3次后，分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養液(共2瓶)、含10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋的終濃度為80 μg/mL(2瓶)并含5%FBS的紅景天苷溶液。標記組別(對照組和紅景天組)和時間后，繼續培養48 h，對照組吸棄舊液，紅景天苷組吸取舊液離心，PBS溶液洗滌3次后，每瓶加入500 μL蛋白裂解液，冰上裂解2～3 h，提取細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。100 ℃變性5 min，每孔上樣40 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳,恒壓95 V 90 min分離樣品；200 mA轉膜35～50 min；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加5%脫脂奶粉稀釋的IMP3，4 ℃過夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫孵育2～3 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL發光。使用Image lab軟件分析目的蛋白與內參的灰度值，通過目的蛋白IMP3與β-actin內參照灰度值對比，得出相對量。

1.2.4RT-PCR檢測宮頸癌Siha細胞中IMP3的mRNA表達按Trizol總RNA 抽提試劑盒所附說明提取待測細胞中總RNA。紫外分光光度儀測定其濃度后， 取1 ng RNA，在離心管內加入Oligo(dT)15、dNTP、RNA 酶抑制劑、DEPC水,在逆轉錄酶MMLV 的催化下獲得cDNA。所有的引物均由寶生物工程大連公司合成(表1)。以2%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR結果。用Image lab軟件對結果進行光密度掃描分析，以相應目的條帶IMP3吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值進行半定量分析。

表1　IMP3、β-actin RT-PCR引物序列

2　結　果

2.1紅景天苷對宮頸癌Siha細胞增殖的影響采用CCK-8檢測紅景天苷對Siha細胞生長增殖抑制的影響，在20～640 μg/mL濃度，不同濃度的紅景天在不同的作用時間下(24、48、72 h)對Siha細胞均有抑制作用，且隨紅景天苷濃度的增高及作用時間的延長，宮頸癌Siha細胞增殖抑制率也逐漸增高(表2)。以紅景天苷濃度在640 μg/mL，作用72 h時的抑制率最高，抑制率為97.46%±0.54%；不同濃度紅景天苷作用Siha細胞48 h的抑制曲線較好，其中紅景天苷80 μg/mL作用Siha細胞48 h的抑制率為49.80%±0.46%。不同藥物濃度對宮頸癌Siha細胞增殖抑制率的單因素方差分析，24、48、72 h的F值分別為23.73、134.687、34.21，均P<0.01。提示紅景天苷對宮頸癌Siha細胞的增殖抑制率具有時間和濃度雙重依賴性。以80 μg/mL紅景天苷濃度分別作用24、48、72 h進行單因素方差分析，F=70.56，P<0.01。故選取48 h IC50，80 μg/mL作為干預濃度，為紅景天苷組。宮頸癌Siha細胞為對照組。

2.2Western blot檢測紅景天苷對宮頸癌Siha細胞IMP3蛋白表達的影響對照組與紅景天苷組中宮頸癌Siha細胞IMP3可見特異性的蛋白條帶(圖1)，對照組IMP3蛋白表達量(0.306 6±0.220 8)高于紅景天苷組(0.018 8±0.002 3)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3RT-PCR檢測紅景天苷對宮頸癌Siha細胞IMP3 mRNA表達的影響對照組中IMP3 mRNA的表達量(0.621 1±0.498 8)高于紅景天苷組(0.014 6±0.009 3)，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

表2　不同濃度紅景天苷對Siha細胞增殖的抑制作用

圖2　IMP3 mRNA在宮頸癌Siha細胞中的表達

3　討　論

在我國，每年有約130 000例新增宮頸癌病例，占全球全年新增病例的1/3；每年有53 000例因宮頸癌死亡例數，占全球宮頸癌死亡例數的1/4[6]。目前，治療宮頸癌的主要手段是放化療作用配合手術切除，超過35%的局部晚期宮頸癌患者經過手術治療或者放療后，將發展為持續性/復發/轉移性宮頸癌，鉑類為基礎的順鉑作用仍然是治療的金標準[7]。但鉑類藥物由于不良反應影響，而使患者生活質量下降，預后較差。

紅景天苷是紅景天屬植物的主要活性成分，具有抗衰老、抗疲勞以及抗缺氧作用，對心臟、腦、神經、腎具有保護作用，以及抗癌和抗細胞凋亡等多種作用[8]。紅景天苷通過調節細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinases 4，CDK4) - 細胞周期蛋白 D1(cyclin D1)途徑而抑制G1期，或者通過調節細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)-細胞周期蛋白 B1(cyclin B1)途徑抑制G2期來發揮細胞毒活性[9]。已有研究顯示，經紅景天苷處理的肝癌細胞在G0/G1期百分數明顯增加，S期和G2/M期細胞減少，表明腫瘤生長在G0/G1期被阻斷。提示紅景天苷可在此期抑制腫瘤DNA的合成和復制。本實驗采用CCK-8檢測不同濃度紅景天苷對Siha細胞增殖的影響，結果表明紅景天苷對Siha細胞的增殖抑制率具有時間和濃度雙重依賴性。

IMP3又名KOC或L523S，在人類早期胚胎中發揮重要作用，在成人正常組織中很少或無表達[10-11]。但在人乳腺癌、非小細胞肺癌、胃腫瘤、膀胱癌、宮頸腺癌等各種惡性腫瘤中IMP3高表達，在惡性腫瘤周圍的良性組織中不表達[12-16]。IMP3屬于IGF-Ⅱ的mRNA結合蛋白(IMP)家族，由IMP1、IMP2和IMP3組成。IMP3與IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR結合，通過促進IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的翻譯使IGF-Ⅱ蛋白的表達上調而發揮致癌作用[17]。IGF-Ⅱ與IGF-ⅠR結合后，使其內在的酪氨酸酶活化，活化的酪氨酸酶介導PI3K/AKT和RAF/MAPK信號傳導通路，從而促進腫瘤細胞增殖分化，抑制凋亡[18]。劉紀昀等[19]采用免疫組化及原位雜交方法檢測20例正常宮頸上皮，35例宮頸上皮內瘤變，50例宮頸鱗狀細胞癌組織中的IMP3蛋白表達情況，發現IMP3蛋白陽性表達率隨著宮頸病變程度的增高而增加，提示IMP3在鑒別宮頸良惡性病變方面具有參考意義。同時有研究證實，IMP3的過表達與宮頸病變的程度有關，IMP3主要是在宮頸鱗狀細胞癌患者中表達，并能預測腫瘤侵襲性的FIGO分期、淋巴結轉移、血管浸潤密切相關。因此，IMP3被認為與腫瘤侵襲性相關[20]。本研究顯示，經80 μg/mL紅景天苷作用的宮頸癌Siha細胞中IMP3蛋白和mRNA表達均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。結合已有研究推測，在未經任何治療的宮頸癌患者組織中IMP3表達，可以預測宮頸癌侵襲性腫瘤的行為，也可以作為預后不良的預測因子之一。本次實驗表明，紅景天苷可降低宮頸癌Siha細胞中IMP3的表達，提示紅景天可能通過阻斷IMP3與IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR結合，負性調節PI3K/AKT和RAF/MAPK信號傳導通路，抑制Siha細胞生長。梁穎等[21]用紅景天注射液輔助化療治療非小細胞肺癌晚期對患者血清VEGF表達的影響發現，紅景天對非小細胞肺癌組織中VEGF的陽性表達具有良好的抑制作用，它可以有效作用于腫瘤組織，推測紅景天苷可以用于臨床治療宮頸癌。

本實驗以宮頸癌Siha細胞為研究對象，初步探討紅景天苷抑制宮頸癌Siha細胞增殖的作用機制，后續將建立動物模型進一步研究紅景天苷對小鼠宮頸癌移植瘤的影響情況，以及利用PD98059(MAPK信號通路特異性阻斷劑)、LY294002 (PI3K信號通路特異性阻斷劑)分別阻斷MAPK、PI3K信號通路，進一步探討紅景天苷在宮頸癌中的作用機制。

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四川省教育廳項目(12ZB225)；川北醫學院發展基金項目(CBY-A-QN02)；川北醫學院學生科創基金(15263)。作者簡介：高瑾(1979-)，主治醫師，本科，主要從事腫瘤病理的研究。△

，E-mail:zlx0624@qq.com。

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1671-8348(2016)27-3849-03

2016-02-11

2016-04-17)