基于凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷的模型研究*

覃弘宇，李　銀，李定祥，鄧奕輝

(湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室/細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，長沙 410208)

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論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.007

基于凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷的模型研究*

覃弘宇，李銀，李定祥，鄧奕輝△

(湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室/細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，長沙 410208)

目的探索凝血酶合并缺氧對PC12細胞損傷的最佳反應時間點，為進一步研究凝血酶在缺血性腦損傷中的意義提供實驗方法。方法建立體外缺氧合并凝血酶誘導的PC12細胞損傷模型。按照常規細胞培養方法，采用三氣培養箱(1%O2，5%CO2，94%N2)和無糖DMEM培養液造成細胞缺氧模擬缺血，并同時加入不同濃度的凝血酶(0、50、100、150和200 U/mL)，再將每組都作用于1、6、12、24 h后，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)分析細胞的存活率、TUNEL法檢測細胞的凋亡程度。結果隨著缺氧時間的延長和凝血酶濃度的增加，細胞存活率逐漸下降，TUNEL細胞陽性率和凋亡率逐漸升高。低濃度凝血酶(50 U/mL)在缺氧1 h后，與對照組(0 U/mL)相比細胞存活率有所升高，提示低凝血酶可能有保護作用。尤以缺氧12 h后開始細胞損傷更為明顯，150 U/mL凝血酶組作用12 h后與對照組相比細胞存活率顯著下降(P<0.01),凋亡率顯著增加(P<0.05)；且200 U/mL凝血酶作用12 h和150、200 U/mL凝血酶組作用24 h后細胞存活率與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論150 U/mL凝血酶在缺氧作用12 h后為研究凝血酶合并缺氧對PC12細胞損傷的最佳模型條件。

PC12細胞；凝血酶；缺氧；細胞損傷

急性缺血性卒中 (acute ischemic stroke，AIS) 是最常見腦卒管疾病之一，占各類腦卒中(stroke)的60%～80%[1]。因血液循環障礙,如缺血、缺氧等所致的局限性腦組織的缺血性壞死和軟化，所以該病具有發病急、治療時間窗短、致殘率及復發率高等特點[2]。AIS的基本病理過程是腦血管阻塞和隨之發生的腦細胞損傷，其發生機制的學說主要有能量耗竭、興奮性氨基酸毒性、梗死灶周邊半暗帶去極化、炎性細胞因子、鈣離子超載、一氧化氮(NO)和自由基損傷、細胞凋亡等[3-6]。近年來，凝血酶在AIS發生發展中的作用受到了學術界的重視[7-8]，以凝血酶作為藥理作用靶點來研究AIS具有重要價值；腦缺血的模型報道有很多，為模擬機體內急性缺血的損傷機制，通常以建立體外的腦缺血細胞模型來模擬缺血性腦損傷；而因PC12細胞經神經細胞生長因子(nerve growth factor,NGF)刺激誘導后可以向交感神經元分化，而具有神經元功能[9]；故本實驗利用PC12細胞在凝血酶合并缺氧的環境下模擬腦缺血后神經細胞，觀察不同凝血酶濃度對細胞損傷的情況，探索其損傷的最佳時間點，從而為研究腦缺血合并凝血酶細胞損傷的機制和藥物防治提供實驗方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑胰蛋白酶(Sango公司)，DMEM HIGH GLUCOSE(1X)培養基(美國HyClone試劑公司,批號NAC1362)；鏈霉素青霉素混合溶液(100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素)、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)均購自Gibco公司；胎牛血清(美國HyClone試劑公司,批號 NWK0489)；凝血酶(中國Solarbio試劑公司 批號 106A069)；二甲基亞砜(DMSO,美國MP Biomedicals，批號196055)；噻唑藍(3-4,5-dimethyl-2-thiazoly-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，中國Solarbio公司，批號M8181)。TUNEL試劑盒(瑞士Roche試劑公司，批號11684817910)。

1.1.2細胞 PC12細胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(高分化，永生性)，購自長沙贏潤生物技術有限公司，編號2015032007。

1.1.3主要儀器倒置顯微鏡(重慶，型號：XDS-1B)，普通二氧化碳培養箱(德國賀利氏，Heracell)，三氣培養箱(Thermo，3131)，SP-756型紫外分光光度計(上海光譜，ZW0907060805)，酶標儀(美國，ELX800)。

1.2實驗方法

1.2.1PC12細胞的培養及缺氧合并凝血酶損傷模型的建立PC12細胞以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM高糖培養基于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下的培養箱中培養，2 d換液一次，待細胞成長融合后傳代培養。細胞以1×105個/mL接種于96孔培養板，每孔0.18 mL，培養24 h待細胞貼壁后再加終濃度為50 μg/L的神經生長因子(NGF)誘導分化并繼續培養72 h后[5]，吸棄原培養液；將細胞隨機分為5組，分別為0 U/mL凝血酶組(對照組)、50 U/mL凝血酶組，100 U/mL凝血酶組，150 U/mL凝血酶組和200 U/mL凝血酶組。每組設8個復孔，分別加入0、50、100、150、200 U/mL濃度的凝血酶10 μL和100 μL無血清培養基，置于三氣培養箱中(5%CO2，1%O2，94%N2)培養模擬缺氧缺血過程。不同濃度凝血酶組按1、6、12、24 h時間點依次培養孵育后取出。制備不同濃度(0、50、100、150、200 U/mL)不同時間點(1、6、12、24 h)缺氧合并凝血酶損傷模型。

1.2.2指標檢測

1.2.2.1細胞生存率測定[四甲基偶氮唑藍(MTT法)]分別取上述不同時間點處理的細胞檢測，加10 μL 5 mg/mL的MTT于培養箱中培養4 h后，吸去上清液加150 μL的DMSO，振蕩10 min后于490 nm波長處檢測吸光度值(A)。A值越大，表明細胞存活率越高，細胞損傷越小。

1.2.2.2細胞凋亡率檢測(TUNEL檢測)細胞固定爬片后，去掉孔板中的培養基加入固定液固定后，吸棄固定液加破膜工作液覆蓋爬片，常溫下孵育10 min，取Tunel試劑盒內適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1∶9混合，用錫紙包住平放于水浴鍋內，滴加適量DAPI染液到爬片上，室溫避光孵育5 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

2　結　果

2.1NGF誘導前后PC12細胞形態的變化初次復蘇PC12細胞在培養基中呈懸浮狀態，胞體圓形，處于游離期細胞貼壁能力較差，易聚集成團，呈半懸浮狀態；培養24 h后細胞開始貼壁生長并分裂增殖，吸附期PC12細胞在培養基中多呈橢圓或多角形，傾向于聚集成團簇狀；培養約72 h后，細胞進入對數生長期，此時細胞快速生長和分裂，細胞折光性強，數目明顯增多。NGF誘導PC12細胞轉化神經元樣細胞的培養后，隨培養時間延長，細胞數量無明顯增加，細胞長出突觸增粗增長，貼壁牢固；培養7 d后基本無法消化傳代；培養10 d后細胞進入衰退期。形態學觀察培養24 h可見細胞長出較短、較細的突觸；48 h突觸數量及長度增加；72 h突觸長度可達胞體的4～5倍，交織成網狀，呈典型的神經元形態，占總數96%以上。

2.2細胞存活率變化隨著時間的缺氧時間的延長和凝血酶濃度的增加，細胞存活率逐漸下降。50 U/mL凝血酶組在缺氧1 h后，與對照組相比細胞存活率有所升高，提示低凝血酶可能有保護作用。隨著時間的延長，細胞存活率逐漸下降(圖1)，1、6、12、24 h均出現不同程度的細胞損傷，尤以缺氧12 h后細胞損傷更為明顯，150、200 U/mL凝血酶組作用12 h后與對照組相比細胞存活率顯著下降(P<0.01)。見表1。

圖1　各時間短不同濃度凝血酶的作用

組別1h6h12h24h對照組0．8217±0．02230．7456±0．02100．6913±0．01780．6179±0．016450U/mL凝血酶組0．8517±0．02120．7312±0．02090．6639±0．01650．5839±0．0155100U/mL凝血酶組0．8091±0．02080．7156±0．01980．6544±0．01610．5771±0．0145150U/mL凝血酶組0．7968±0．01990．7074±0．01980．5573±0．0156b0．4980±0．0123b200U/mL凝血酶組0．7852±0．01770．6770±0．0153a0．4777±0．0122b0．4319±0．0098b

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組相比。

2.3TUNEL法檢測細胞的凋亡程度比較TUNEL熒光染色法檢測細胞凋亡，對照組細胞細胞核呈藍色熒光，見極少量的綠色熒光，細胞核形狀為較規整橢圓形，染色質分布均勻，未見明顯凋亡細胞。在缺氧1、6 h時間點，隨著凝血酶濃度的增加，綠色熒光細胞的數量較對照組有所增加，可見核形態不規則的細胞。缺氧12 h，50 U/mL和100 U/mL凝血酶濃度下，綠色熒光細胞的數量進一步增加，當凝血酶濃度達到150 U/mL，綠色熒光細胞的數量明顯增多，可見細胞核固縮、碎裂，細胞死亡數量增加。缺氧達到24 h后，細胞多數死亡，藍色熒光細胞數量已明顯減少。見表2，圖2～5。

圖2　凝血酶150 U/mL作用1 h(×200)

圖3　凝血酶150 U/mL作用6 h(×200)

圖5　凝血酶150 U/mL作用24 h(×200)

表2　不同時間不同濃度凝血酶細胞的凋亡率比較

續表2　不同時間不同濃度凝血酶細胞的凋亡率比較

3　討　論

缺血缺氧是缺血性腦卒中導致神經損傷的重要因素。研究發現，大腦能夠耐受低氧而不產生功能性損害的時間約為5 min，如果缺血時間較長，將導致神經細胞發生不可逆性死亡。另一方面，凝血酶在缺血性腦卒中發生發展中的作用越來越受到學術界的重視，凝血酶不僅是血液凝固血栓形成的關鍵水解酶，而且也通過與蛋白酶活化受體(PAR)結合發揮對神經細胞的毒性作用。很多研究證明，凝血酶原mRNA在腦組織，尤其是對缺血敏感的組織，如大腦皮質、紋狀體、下丘腦、海馬和小腦均有表達。缺血性腦血管病患者及其高危人群中，神經細胞內凝血酶原的mRNA的表達上調，凝血酶生成增加[7]。研究認為凝血酶還可能通過與其受體結合，誘導炎性細胞與血管內皮細胞膜上黏附分子ICAM-1、VCAM-1結合進而向血管外浸潤，表達和產生單核細胞趨化蛋白(MCP-1)和IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素(IFN)、核轉錄因子κB(NF-κB)等炎癥因子[10-12]，促發炎癥反應，加重神經細胞損害。MCAO模型大鼠的缺血中心區域凝血酶的活性增加，凝血酶原基因表達上調可持續數小時。

體外實驗顯示，凝血酶對神經元具有損傷作用，凝血酶的非蛋白水解活性可以激活小膠質細胞，使小膠質細胞胞內鈣離子明顯增加，增強小膠質細胞吞噬作用。體內實驗研究表明，凝血酶注入腦內6 h后可檢測到凋亡的神經細胞，并且Caspase-3的活性明顯增加[10]；凝血酶可誘導腦VEC炎性黏附分子表達，改變血腦屏障(BBB)的通透性[13]。所以本研究采用對PC12細胞進行體外培養，利用NGF刺激誘導PC12細胞，使其向神經元分化，用于神經元的凝血酶合并缺氧模型的建立；旨在通過本模型探討凝血酶毒性反應在AIS病理生理過程中的地位，從而更加真實地模擬AIS后神經細胞所處的微環境，更加貼近于臨床。凝血酶對于神經元的毒性作用與時間、劑量呈依賴關系。本研究觀察了不同濃度(0、50、100、150、200 U/mL)的凝血酶在不同時間點(1、6、12、24 h)對PC12細胞分化的影響。結果顯示，凝血酶對PC12細胞具有直接的毒性損傷作用，低濃度的凝血酶作用較短時間可能對細胞具有一定的保護作用，隨著作用時間的延長，凝血酶對細胞毒性損傷作用增加。MTT對細胞存活率的檢測結果表明50 U/mL低濃度的凝血酶可能對細胞具有一定的保護作用，原因可能是低濃度凝血酶(50 U/mL)在缺氧1 h左右細胞處于對缺氧損傷的可逆修復期，此時如果馬上進行氧的供應可以降低細胞的損傷，與之前文獻的報道相符。隨著作用時間的延長，在6、12、24 h均對細胞具有毒性損傷作用，150 U/mL凝血酶在作用12 h后對細胞的損傷與對照組相比差異具有統計學意義。而24 h組的細胞存活率較低，不利于之后實驗的進行。6 h組200 U/mL凝血酶與12 h組150 U/mL凝血酶相比，二者對細胞的損傷無明顯差異，而150 U/mL的凝血酶與腦出血血腫內凝血酶濃度更為接近。凝血酶合并缺氧在不同時間均可以造成細胞損傷，隨著時間的延長及凝血酶濃度的增加，對細胞的損傷逐漸加重，故選擇150 U/mL凝血酶在缺氧作用12 h后為研究凝血酶合并缺氧對PC12細胞損傷的最佳模型條件。

凝血酶的分子信號作用是通過其受體的介導來實現的，但其作用的確切靶點及信號轉導通路尚未明確，通過對凝血酶合并缺氧對PC12細胞損傷模型的探索，進一步研究凝血酶對神經細胞損傷的相關機制，為實現防治AIS后凝血酶毒性作用可能具有更大的理論和現實意義。

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Model of PC12 cell injury induced by thrombin combined with hypoxia*

Qin Hongyu,Li Yin,Li Dingxiang,Deng Yihui△

(KeyLaboratoryofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineforPreventionandTreatmentofCardiacandCerebralofHunanTraditionalChineseMedicineUniversity/KeyLaboratoryofCellBiologyandMolecularTechnologyofUniversitiesandCollegesofHunanProvince,Changsha,Hunan410208,China)

ObjectiveTo explore the optimal reaction time of thrombin combined with hypoxia on PC12 cell injury,and to provide experimental method for the study of the significance of thrombin in ischemic brain injury.Methodsthe PC12 cell injury model induced by hypoxia in vitro was established.In the conventional cell culture method,three 1%O2(5%CO2,6 h,94%N2) and DMEM (24 h) cells were used to simulate ischemia,and four (50,150 and 200 U/ml) were added to the different concentrations of thrombin (0,100,and 12 h).Cell survival rate was detected by MTT and apoptosis rate of cell was detected by TUNEL.Resultsthe survival rate of the cells decreased,the positive rate and apoptosis rate of TUNEL cells increased gradually with the increase of time and the concentration of thrombin.Low concentrations of thrombin (50 U/mL) in hypoxia 1H,compared with the control group (0 U/mL),the survival rate increased,suggesting that low thrombin may have protective effect.The cell viability was significantly decreased (P<0.01),and the apoptosis rate was significantly increased (P<0.05),and the difference was statistically significant(P<0.05) between 200 U/mL and control group(U/mL) after 12 h was significantly decreased (12 h).ConclusionThrombin combined with hypoxia in different time can cause cell damage,with the increase of time and thrombin concentration,the damage of cells increased gradually,the MTT and TUNEL cells apoptosis,the minimum dose of thrombin induced damage to PC12 cells,150 U/mL thrombin in the role of 12 h cells after the damage and compared with the control group,it has significant statistical significance,therefore,the optimal model for the damage of PC12 cells after 150 U/mL was selected.

PC12 cells;thrombin;anoxia;cell injury

湖南省自然科學基金資助項目(13JJ6061，14JJ2113)；湖南省中醫藥科研基金資助項目(201319)；湖南省教育廳資助項目(12A105)；湖南省重點學科中西醫結合基礎資助項目；湖南省自然科學創新群體基金資助項目；湖南省高校科技創新團隊資助。作者簡介：覃弘宇(1990-)，在讀碩士，主要從事中西結合防治糖尿病血管并發癥研究。△

，E-mail:644138330@qq.com。

R743.3

A

1671-8348(2016)27-3766-04

2016-02-13

2016-04-06)