脂聯素后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用*

趙林靜，鄧保國，楊保勝，張金盈

(1.新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉 453003；2.鄭州大學第一附屬醫院心血管內科，鄭州 450000)

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論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.006

脂聯素后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護作用*

趙林靜1,2，鄧保國1，楊保勝1，張金盈2

(1.新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉 453003；2.鄭州大學第一附屬醫院心血管內科，鄭州 450000)

目的探討脂聯素(ADP)后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷(MIRI)是否有保護作用。方法SD大鼠隨機分為：(1)假手術組(Sham組)，冠狀動脈左前降支(LAD)僅穿線不斷流；(2)心肌缺血-再灌注損傷組(MIRI組)，LAD結扎30 min后再灌注120 min；(3)脂聯素后處理組(ADP組)，LAD再灌注前20 min注射ADP，其余同MIRI組。檢測各組血漿乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI) 和丙二醛(MDA)的水平，檢測心肌超氧化物歧化酶(SOD)和MDA的水平，各組心肌HE染色并描記心電圖。結果MIRI組血漿LDH(735.21±110.92)U/L、cTnI(37.96±5.97)μg/mL和MDA(4.55±0.18)nmol/L較Sham組升高 (P<0.05)，ADP組血漿LDH(579.25±69.01)U/L、cTnI(21.07±5.77)μg/mL和MDA(2.99±0.22)U/L水平較MIRI組降低(P<0.05)；與Sham組相比，MIRI組心肌SOD水平(11.47±1.67)U/mg降低而MDA水平(7.99±0.59)nmol/mg升高(P<0.05)；與MIRI組相比，ADP組心肌SOD水平(13.93±0.97)U/mg升高而MDA水平(5.74±0.64)nmol/mg降低(P<0.05)。結論ADP后處理可以減輕大鼠MIRI，可能與減少脂質過氧化和增強自由基清除有關。

脂聯素;再灌注損傷；心肌；缺血后處理

隨著近年靜脈溶栓、經皮冠脈腔內成形術和冠脈旁路移植術等方法被廣泛應用于心血管臨床，急性心肌梗死的病死率有所下降，但是同時心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)包括心肌抑頓和再灌注心律失常等現象愈發引起關注，成為臨床亟待解決的問題。針對MIRI，缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)被公認為是最強的心肌保護措施，但患者心肌缺血事件的發生難以預測，各種臨床治療均是在心肌缺血后實施的，所以在2003年提出的缺血后處理(ischemic postconditioning,IPO)的概念更貼近臨床，成為抗MIRI的研究熱點。但由于單純IPO對機體是有損操作，臨床并不可行，于是各種藥物IPO得到了更多關注，其中脂聯素(adiponectin，ADP)因其廣泛的藥理作用而備受關注。吳芹等[1]發現提高ADP水平可增強心臟IPC對大鼠MIRI 的保護作用，本組前期實驗也證實ADP可以增強大鼠肢體IPC對MIRI 的保護效應[2]，但ADP后處理對大鼠MIRI是否具有保護作用還研究甚少。本實驗在大鼠心肌缺血再灌注前給予ADP后處理，觀察ADP后處理是否對MIRI有保護作用，以期為臨床MIRI的早期干預提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及試劑儀器清潔級SD大鼠30只，體質量220～280 g，由河南省實驗動物中心提供。所有動物適應性飼養1周，實驗前禁食12 h，不禁水。主要試劑：脂聯素購自美國Phoenix公司，批號426002；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒，丙二醛(MDA)試劑盒和心肌肌鈣蛋白I (cTnI)試劑盒均購自美國R&D公司。主要儀器：光學顯微鏡(上海豫光儀器公司)，Lei Ca RM 2235切片機，DHX-150B型動物呼吸機(特力麻醉呼吸設備公司)，ECG-100型心電圖機(深圳邦健電子公司)，DNM-9602A型酶標分析儀(成都廣普儀器公司)。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠在體MIRI模型建立大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉(每100克0.3 mL)后仰臥位固定，1%聚維酮碘頸部消毒后分離氣管并穿線后剪開氣管，插入氣管插管連接呼吸機進行機械通氣支持(潮氣量15～20 mL，呼吸頻率每分鐘70～80次，呼吸比1.0∶1.5)，分別經四肢插入針型電極描記標Ⅱ導聯心電圖，按照本組前期操作[3]，建立大鼠MIRI模型。

1.2.2動物分組造模成功的大鼠隨機分為以下3組，每組10只：(1)假手術(Sham)組，開胸后分離冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)后并不結扎斷流；(2)MIRI組，LAD穿線后結扎斷流血流30 min后松開線結再灌注120 min；(3)脂聯素后處理組(ADP組)，藥物后處理的時間點采用本組前期常規操作即在LAD再灌注前20 min經股靜脈注射ADP(1.8 μg/g)，其余操作同MIRI組。

1.2.3標本留取和指標檢測各組動物LAD缺血再灌注120 min后(Sham組LAD僅穿線后150 min)，自頸總動脈取血2～3 mL，3 500 r/min離心10 min后取上清液，分裝入Eppendorf管待檢。用ELISA法檢測血漿LDH、SOD、MDA和cTnI含量。同時摘取大鼠心臟用生理鹽水反復洗滌，剪下左心室心肌放入凍存管入液氮凍存。測定時稱取心肌200 mg，剪碎后移入裝有2 mL冷生理鹽水的勻漿管中冰浴勻漿，3 500 r/min離心15 min后收集上清液，用ELISA法檢測心肌SOD和MDA水平。最后每組取2只大鼠迅速摘取心臟，在左心室最大橫徑處橫切并去除左心耳，經4%多聚甲醛固定后HE染色。

2　結　果

2.1各組大鼠血漿LDH、cTnI和MDA的水平MIRI組大鼠血漿LDH、cTnI和MDA水平與Sham組相比升高(P<0.05)，ADP組血漿LDH、cTnI和MDA水平較MIRI組降低(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠血漿LDH、cTnI和MDA水平

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與MIRI組比較

2.2各組大鼠心肌SOD和MDA水平與Sham組相比，MIRI組心肌SOD水平降低而MDA水平升高 (P<0.05)；與MIRI組相比，ADP組心肌SOD水平升高而MDA水平降低(P<0.05)，見表2。

表2　各組大鼠心肌中SOD和MDA水平

a：P<0.05，與Sham組比較；b：P<0.05，與MIRI組比較

2.3各組大鼠心肌形態學結果各組大鼠心臟標本HE染色后，光鏡下可見：Sham組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌橫紋清晰，心內膜內皮完整；MIRI組大鼠部分心肌纖維出現溶解和斷裂，肌間質間隙擴大，橫紋不清晰，心內膜內皮不完整；ADP組和MIRI組相比大鼠心肌的病理損傷有所減輕。見圖1～3。

圖1　Sham組心肌HE染色(×400)

圖2　MIRI組心肌HE染色(×400)

圖3　ADP組心肌HE染色(×400)

2.4各組大鼠標Ⅱ導聯心電圖結果Sham組大鼠心電圖結果正常，MIRI組大鼠心電圖呈明顯急性缺血性改變，ADP組和MIRI組相比心電圖急性缺血性改變明顯減輕。結果見圖4～6。

圖4　Sham組標Ⅱ導聯心電圖

圖5　MIRI組標Ⅱ導聯心電圖

圖6　ADP組標Ⅱ導聯心電圖

3　討　論

大鼠心血管解剖結構包括冠狀動脈支配區，與人體非常相似，MIRI的發生率較高，因此大鼠是MIRI理想的研究對象[4]。本實驗選用8周齡以上大鼠，體質量超過220 g，處于性成熟期的成年階段，對各種損傷抵抗力相對較強。

ADP是由脂肪細胞分泌的一種血漿細胞因子性蛋白質。研究發現，高血壓和冠心病等患者ADP水平明顯降低，提示ADP具有心臟保護作用[5]。在動物實驗中有更多關于ADP心臟保護的報道，有學者報道大鼠MIRI越嚴重，ADP水平下降越明顯，當使用ADP基因敲除大鼠制作MIRI模型，可見心肌梗死范圍明顯擴大，當采用腺病毒介導ADP 轉染則可減少梗死面積[6]。

LDH及cTnI正常主要存在于心肌和骨骼肌中，血中含量很低。當心肌損傷和大量細胞死亡時逸出入血，且二者升高水平與心肌損傷程度大致平行[7]。cTnI是心肌眾多調節蛋白中的重要成分，作為新的心肌損傷評價指標近年廣受重視。因為cTnI相對分子質量較小僅為22 500，心肌受損初期即可入血并在血中持續時間長，所以敏感性強，被稱為檢測心肌受損程度的“金標準”[8]。本實驗中MIRI組血清LDH和cTnI含量比Sham組明顯升高，提示存在MIRI;ADP組血清LDH和cTnI含量較MIRI組降低，提示ADP后處理對MIRI有保護作用。

氧自由基化學性質活潑，能對生物大分子如DNA堿基、蛋白質和脂質等造成過氧化損傷形成氧化應激狀態，通過損傷DNA堿基，產生蛋白氧化產物及脂質過氧化等導致組織損傷，參與了多種疾病的發生發展[9]。心肌缺血再灌注產生的氧自由基能攻擊生物膜，引發脂質過氧化，最終導致細胞損傷。心肌缺血再灌注過程中，通過白細胞“呼吸暴發”等途徑自由基的產生急劇增多[10]。

MDA化學性質十分穩定，是自由基攻擊膜性成分多不飽和脂肪酸的終產物，組織MDA水平是反映自由基損傷程度的重要指標[11]。SOD是體內主要的酶性自由基清除劑，清除過程中SOD被大量消耗，所以MDA和SOD水平可反映機體脂質過氧化損傷程度。本試驗中MIRI組血清心肌酶含量增高，同時血漿和心肌中MDA水平升高而心肌SOD水平下降，提示心肌的脂質過氧化可能參與了MIRI，推測SOD水平降低與在清除自由基過程中被大量消耗有關。

目前發現，ADP也有抗氧化應激的作用，能減少活性氧產生并改善內皮功能[12]；通過細胞培養和臨床實驗都證實了ADP可以改善細胞氧化應激狀況[13-14]。有學者通過ADP對人心肌細胞氧化應激的干預指出，ADP可以通過降低銜接蛋白P66shc mRNA表達，使磷酸化的p66shc表達減少，降低人心肌細胞的氧化應激水平[15]。此外袁芳等[16]也通過動物實驗證實ADP能通過刺激腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化而抑制活性氧產生和減少MDA的生成，從而減緩氧化應激反應。

在臨床實驗中也提示ADP和氧化應激也有關系[13]。林書坡等[3]通過臨床病例分析指出，ADP與冠狀動脈粥樣硬化過程中的脂質代謝異常及氧化應激密切相關，ADP和機體氧化應激狀態可能在冠心病包括急性心梗的發病中起重要作用。本實驗中ADP組血漿和心肌MDA含量下降而心肌SOD含量升高，提示減少脂質過氧化和加強自由基清除可能參與了ADP后處理對MIRI的保護；MIRI組血清心肌酶含量增高，同時血漿和心肌MDA含量升高而心肌SOD含量下降，提示心肌的脂質過氧化參與了MIRI。

通過脂聯素等藥物IPO對大鼠MIRI的研究，提示是否臨床可以對急性心梗患者采取類似的藥物后處理來保護缺血心肌。綜上所述，本實驗從藥物后處理的角度對MIRI的防治進行了探討，提示ADP缺血后處理對大鼠MIRI具有保護作用，可能與增強自由基清除和減少脂質過氧化反應相關，但深入機制還有待于進一步研究。

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The role of adiponectin postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in rats*

Zhao Linjing1,2,Deng Baoguo1,Yang Baosheng1,Zhang Jinying2

(1.SchoolofBasicMedical,XinxaingMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China;2.DepartmentofVasculocardiology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China)

ObjectiveTo study the role of adiponectin (ADP) postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI) in rats.MethodsSD rats were divided randomly into 3 groups：⑴Group Sham were processed identically except the left anterior descending coronary artery(LAD) and was not ligated;⑵Group MIRI were subjected to LAD occlusion for 30 min and reperfusion for 120 min;⑶Group ADP were subjected to ADP injection before reperfusion.The titer of lactate dehydrogenase(LDH),cardiac troponin I(cTnI) and malondialdehyde(MDA)in plasma were observed.The levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in myocardial tissue were observed.The results of HE staining and electrocardiograms(ECG) was observed.ResultsCompared with Group Sham,LDH,cTnI and MDA in plasma in Group MIRI increased (P<0.05);Compared with Group MIRI,LDH,cTnI and MDA in plasma in Group ADP declined (P<0.05);Compared with Group Sham,SOD decreased and MDA increased in myocardial tissue in Group MIRI (P<0.05);Compared with Group MIRI,SOD increased and MDA decreased in myocardial tissue in Group ADP (P<0.05).The myocardial injury was serious in Group MIRI while it was lightened in Group ADP.There were acute ischemia ECG change in Group MIRI while it was slight in Group ADP.ConclusionADP postconditioning is a protective factor against MIRI in rats,it is related to eliminating free radicals and alleviating the damage of lipid peroxidation.

adiponectin;reperfusion injury;myocardium;ischemic postconditioning

河南省科技廳科技發展計劃基金資助(411045800)。作者簡介：趙林靜(1970-)，講師，在讀博士，主要從事心臟缺血再灌注損傷防治的研究。

R363.2

A

1671-8348(2016)27-3763-03

2016-02-11

2016-04-06)