二膦酸鹽對人骨肉瘤細胞誘導凋亡作用的實驗研究*

買買提艾力·哈斯木，江仁兵，白靖平，徐萬龍

(1.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科,烏魯木齊 830011；2.山東大學齊魯醫院，濟南 250012)

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論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.004

二膦酸鹽對人骨肉瘤細胞誘導凋亡作用的實驗研究*

買買提艾力·哈斯木1，江仁兵1，白靖平1，徐萬龍2△

(1.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科,烏魯木齊 830011；2.山東大學齊魯醫院，濟南 250012)

目的探討二膦酸鹽對人骨肉瘤細胞的誘導凋亡作用及其可能的作用機制。方法將人骨肉瘤MG-63細胞株培養、傳代后將細胞分為兩組：二膦酸鹽400 μg/mL干預組、生理鹽水空白對照組，孵育72 h后，對兩組人骨肉瘤MG-63細胞株行免疫熒光檢測，觀察兩組細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表達；行流式細胞術檢測，觀察兩組細胞的細胞凋亡率。結果二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后，免疫熒光檢測結果可見二膦酸鹽400 μg/mL干預組細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表達，而生理鹽水空白對照組幾乎見不到凋亡因子Caspase-3、Fas的表達；流式細胞術檢測結果觀察到二膦酸鹽400 μg/mL干預組細胞的細胞凋亡率為54.00%，遠大于生理鹽水空白對照組的細胞凋亡率3.10%，差異有統計學意義(P<0.05)，存在明顯的誘導凋亡現象。結論二膦酸鹽對體外人骨肉瘤MG-63細胞株存在很強的誘導凋亡作用。

二膦酸鹽類;骨肉瘤；細胞凋亡；MG-63細胞株

骨肉瘤(Osteosarcoma)是一種好發于青少年，發病率高、惡性程度高、預后差的惡性腫瘤，但目前用于骨肉瘤的化療藥物缺乏特異性、敏感性，不良反應大[1-3]。二膦酸鹽(Bisphosphonates)最初用于治療前列腺癌、乳腺癌骨轉移的臨床治療，目前二膦酸鹽已成為腫瘤研究的熱點藥物。二膦酸鹽已被實驗證明可對多種惡性腫瘤細胞產生抑制增殖、誘導凋亡的作用，但其能否對人骨肉瘤細胞產生抑制增殖、誘導凋亡的作用，以及其機制少見其他方面深入的報道。本文應用二膦酸鹽直接作用于人骨肉瘤細胞，通過免疫熒法檢測人骨肉瘤細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表達，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，探討二膦酸鹽對人骨肉瘤細胞的誘導凋亡作用及其可能的作用機制，以期為二膦酸鹽應用于骨肉瘤的化療奠定實驗基礎和理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗細胞及主要試劑人骨肉瘤細胞MG-63購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，二膦酸鹽購自瑞士Novartis Pharma Stein AG公司，批準文號：注冊證號H20090259。胎牛血清(FBS)購自美國Sigma公司。DMEM高糖培養液(含青霉素和鏈霉素各100 U/mL)購自寶信生物制品有限公司。免疫熒光檢測Caspase-3、Fas試劑購自美國Qiagen公司，流式細胞術檢測試劑購自美國BD Syringe公司。

1.2細胞培養與分組細胞培養與傳代：MG-63細胞培養于含體積分數10% FBS的DMEM高糖培養液，置于在體積分數5% CO2孵育箱內37℃恒溫培養，待細胞長滿瓶底后，棄掉培養液，PBS沖洗2次，用0.25%的胰酶消化7 min，鏡下觀察胞質回縮、細胞間隙增大，立即加入含血清培養液終止消化，吸管反復吹打成單細胞懸液，細胞計數，分瓶培養，取對數生長期細胞用于實驗。細胞每隔3～5 d傳代。細胞活力測定：細胞加入0.4%錐蟲藍，1.0～2.0 min內在倒置顯微鏡下計數細胞總數和死亡細胞數，鏡下觀察，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染，以活細胞的百分數代表細胞活力。細胞計數法：采用血細胞計數法。用乙醇清潔計數板及蓋玻片，制備單細胞懸液用槍頭加入微量細胞懸液，不要溢出蓋玻片。在顯微鏡下，用10倍物鏡觀察計數板四角大方格中的細胞數，細胞壓中線時，只計數左側和上方，不計右側和下方。將計數結果代入公式:細胞數/毫升原液=(大格細胞總數/4)×104×稀釋倍數。每孔接種5×105個MG-63細胞于96孔板中，并將細胞均分為兩組：二膦酸鹽(400 μg/mL)干預組、生理鹽水空白對照組，孵育72 h待用。

1.3免疫熒光檢測兩組骨肉瘤細胞株MG-63細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas的表達將細胞接種于蓋玻片上，細胞過夜貼壁,冷丙酮固定1 min，PBS洗3次，3%BSA室溫封閉30 min，加一抗(用1%BSA稀釋)放在濕盒里，4℃過夜，PBS洗3次，加二抗(用1%BSA稀釋)閉光反應30 min，PBS洗3次，滴入DAPI，避光干燥后指甲油封片，熒光顯微鏡下觀察兩組人骨肉瘤MG-63細胞株中凋亡因子Caspase-3、Fas的表達情況。

1.4流式細胞儀檢測兩組人骨肉瘤MG-63細胞株的細胞凋亡率分別收集膦酸鹽400 μg/mL干預組、生理鹽水空白對照組作用72 h的MG-63細胞，每樣本細胞數為每毫升1×105個，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用孵育緩沖液洗滌1次，用100 μL的標記溶液重懸細胞。1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。上FACS-Claibur流式細胞儀檢測分析。結果判斷標準：在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞(FITC-/PI-)，右上象限是壞死細胞為(FITC+/PI+)，而右下象限為顯現凋亡細胞(FITC+/PI-)。

1.5統計學處理統計結果的處理采用SPSS19.0統計軟件。計數資料用率表示，兩組之間比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05差異有統計學意義。

2　結　果

2.1熒光顯微鏡下觀察兩組人骨肉瘤MG-63細胞株中凋亡因子Caspase-3、Fas的表達二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后，免疫熒光檢測結果可見二膦酸鹽400 μg/mL干預組細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表達，Caspase-3陽性的細胞均發出綠色熒光，細胞核發出藍色熒光(圖1)，Fas陽性的細胞均發出綠色紅光(圖2)，細胞核發出藍色熒光；而生理鹽水空白對照組幾乎見不到凋亡因子Caspase-3、Fas的陽性表達，只能見到細胞核發出的藍色熒光(圖3～4)。

圖2　二膦酸鹽干預組細胞中Fas表達(Fas-TRITC ×400)

圖3　生理鹽水空白對照組細胞中Caspase-3表達(Caspase-3-FITC ×400)

圖4　生理鹽水空白對照組細胞中Fas 表達(Fas-TRITC ×400)

圖5　二膦酸鹽干預組細胞凋亡圖

2.2流式細胞儀檢測兩組人骨肉瘤MG-63細胞株的細胞凋亡率二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后，流式細胞儀檢測結果提示：二膦酸鹽干預組細胞的細胞凋亡率為54.00%(圖5)，遠大于生理鹽水空白對照組的細胞凋亡率3.10%(圖6)，差異有統計學意義(P<0.05)，存在明顯的誘導凋亡現象。

圖6　生理鹽水空白對照組細胞凋亡圖

3　討　論

在臨床上骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，在原發性骨腫瘤中發病率最高，約占35%，好發于青少年，惡性程度高，遠處轉移早，預后差。骨肉瘤細胞的凋亡過程是一個精確調控的過程，骨肉瘤細胞的凋亡涉及細胞內許多基因的調控，而某些基因的表達在抑制腫瘤生長、促進骨肉瘤細胞凋亡方面具有重要意義[4-7]。骨肉瘤細胞的凋亡受多種凋亡通路的調控，其中Caspase和Fas/FasL系統在這個過程中起最為關鍵的作用[8-9]。細胞的凋亡信號通過細胞膜受體途徑(Fas/FasL)或線粒體途徑傳導，依次激活起始凋亡途徑中的Caspase-8、Caspase-9，繼而連鎖激活下游轉導通路和信號的關鍵執行分子Caspase-3，最后開啟了繼而骨腫瘤細胞的啟動凋亡過程[10-12]。

本研究結果可見經二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后，細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表達，而生理鹽水空白對照組幾乎見不到以上兩種因子的陽性表達，提示二膦酸鹽可以通過激活人骨肉瘤MG-63細胞株中的Caspase和Fas/FasL的細胞凋亡信號通路。這與文獻[13-14]的研究結果相似，他們認為Fas基因是骨肉瘤細胞凋亡的關節調控基因，Fas基因在人類染色體10q區域，它所產生的小分子屬于神經生長因子/腫瘤壞死因子(NGF/TNF)的I型跨膜受體蛋白。二膦酸鹽可以通過誘導Fas來開啟細胞程序性死亡的開始，并在人骨肉瘤細胞內不斷將此信號逐級放大，將信號通過相應受體導入細胞核，從而導致腫瘤細胞的凋亡。這個結果也被Yang等[15]所證實，他認為數字Caspase本質屬于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，目前有14種Caspase家族成員發現，以上Caspase家族成員均具有蛋白質酶切作用，其中在骨肉瘤凋亡過程中其最重要的便是Caspase-3蛋白。Caspase-3位于凋亡通路的下游，可被上游的同家族蛋白Caspase-8、Caspase-9所激活，是細胞凋亡的具體執行者。

本研究結果提示，二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后，細胞中凋亡因子Caspase-3、Fas大量表達，表明在骨肉瘤細胞的凋亡過程中，Fas、FasL和Caspase家族在細胞凋亡過程中分別起著發出凋亡死亡信號、感知并轉導信號且逐級放大至細胞內部、接受信號激活級聯反應并產生效應等一系列作用，這與趙意華等[16]的研究結果相同。此系統是細胞凋亡的最主要途徑之一，其中Caspase蛋白的表達是各種細胞凋亡機制的最后共同通路，在細胞的信號傳遞過程中處于重要地位。因此作者認為藥物治療惡性骨肉瘤過程中，Caspase和Fas/FasL系統的激活是導致骨肉瘤細胞凋亡最關鍵的一環。

本文研究結果提示，400 μg/mL的二膦酸鹽作用于人骨肉瘤MG-63細胞株72 h后細胞凋亡率為54.00%，表示臨床上實用小劑量的二膦酸鹽即可對骨肉瘤有很好的治療作用，提示二膦酸鹽可作為新一類敏感而有效、且全身不良反應小的藥物應用于臨床。因此作者認為這就可以減少以下臨床問題：現有化療藥大多為細胞毒性藥物，無特異性，敏感性不高，新輔助化療的大劑量長期聯合用藥不良反應大，容易出現骨髓抑制、心肌、腎臟、性腺等損害，腫瘤的耐藥性等問題沒有解決，化療藥物的敏感性評價較困難等等。而二膦酸鹽低劑量即可有很好的體外骨肉瘤抑制作用，且敏感性高，非細胞毒性藥物，全身不良反應小。

本研究結果顯示，二膦酸鹽對體外人骨肉瘤MG-63細胞株存在很強的誘導凋亡作用，且結合二膦酸鹽處理后的人骨肉瘤MG-63細胞株凋亡因子Caspase-3、Fas大量表達，初步證實二膦酸鹽有抑制骨肉瘤細胞生長，促進凋亡的作用；而且作者認為二膦酸鹽是通過上調人骨肉瘤MG-63細胞株中促凋亡基因Fas的表達，所以骨肉瘤細胞中的Fas/FasL和Caspase介導的死亡信號轉導系統則可能是其作用機制之一。

二膦酸鹽如果被證實對人骨肉瘤細胞具有誘導凋亡作用，再結合其亦能抑制因破骨活性增加而導致的骨吸收，那在臨床上即可殺滅腫瘤，又可抑制骨肉瘤的溶骨性破壞,具有以上雙重特點的二膦酸鹽將在人骨肉瘤的治療中具有極高的臨床應用價值。

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Apoptotic effects of bisphosphonate inosteosarcoma MG-63 cells in vitro*

Maimaitiaili1,Jiang Renbing2,Bai Jingping2,Xu Wanlong2△

(1.DepartmentofBoneandSoftConnectiveTissueTumor,AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;2.QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China)

ObjectiveTo observe the effects of bisphosphonate on the inhibit proliferation and the apoptosis effect in osteosarcoma MG-63 cells in vitro,explore the phosphonic acid salt of bone sarcoma cells,induce apoptosis and its possible mechanism.MethodsSixty three osteosarcoma MG-63 cells were cultured in vitro.After treated with bisphosphonate 400 μg/mL,without bisphosphonate but normal saline,they were incubated 72 h after the application of the two group cell immunofluorescence test;then observe the expression of apoptosis factors Caspase 3 and Fas;Flow cytometry detection line was used to detect the osteosarcoma cell line MG-63 cells apoptosis rate of each group.Results72 h after treatment with bisphosphonate,the expression of apoptosis factor of Caspase-3 and Fas in osteosarcoma MG-63 cells were strongly expressed,and it was observed by immunofluorescent assay,while in blank control group,we could barely see the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Fas;Flow cytometry test results showed that two phosphonic acid salt 400 μg/mL intervention group cell apoptosis rate was 54.00%,far more than normal saline blank control group,of which the apoptosis rate was 3.10%,the difference was statistically significant (P<0.05),there is an obvious phenomenon of induced apoptosis.ConclusionBisphosphonate has a strong apoptotic effects of bisphosphonate in osteosarcoma MG-63 cells in vitro.Bisphosphonate can inhibit osteolysis of osteosarcoma MG-63 cells via regulating the expression of Caspase-3,Fas in osteosarcoma MG-63 cells.Bisphosphonate may serve as a potential therapeutic agent for treatment of osteosarcoma.

bisphosphonates;osteosarcoma;apoptosis;MG-63 cells

國家自然科學基金資助項目(81360276)；新疆維吾爾自治區衛生廳青年科技人才專項科研資金(2012Y07)；新疆醫科大學創新基金(XJC201157)。作者簡介：買買提艾力.哈斯木(1978-),副主任醫師,碩士,主要從事骨與軟組織腫瘤方面研究工作。△

，E-mail:xuwanlong20082008@163.com。

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1671-8348(2016)27-3757-03

2016-02-10

2016-04-06)