攜帶不同HBV抗原基因片段的重組腺相關病毒轉染樹突狀細胞誘導CTL的效應研究*

安　選,劉　勇,向　毅,魏　芳,夏莉娜,鐘　慶,杜　彪,巫貴成△

(1.重慶三峽中心醫院肝病中心，重慶 404000；2.美國阿肯色醫科大學，小石城 72205)

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·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.001

攜帶不同HBV抗原基因片段的重組腺相關病毒轉染樹突狀細胞誘導CTL的效應研究*

安選1,劉勇2,向毅1,魏芳1,夏莉娜1,鐘慶1,杜彪1,巫貴成1△

(1.重慶三峽中心醫院肝病中心，重慶 404000；2.美國阿肯色醫科大學，小石城 72205)

目的了解攜帶不同HBV抗原基因片段的重組腺相關病毒(rAAV-HBV-S、C、E、X)轉染慢性乙型肝炎患者來源的樹突狀細胞(DC)誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的效應。方法采用攜帶不同HBV抗原基因片段的rAAV-HBV-S、C、E、X轉染慢性乙型肝炎患者外周血中分離出的單核細胞，并在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下繼續培養7 d獲得成熟的DC。通過觀察DC的狀態和流式細胞儀(FACS)檢測各段HBV轉染后DC分化抗原(CD)的表達，評價其成熟與功能。將同一個體的DC與T細胞混合培養制備CTL，通過四甲基偶氮唑鹽(MTS)細胞殺傷實驗研究被激活的CTL對HBV感染的靶細胞HepG2.2.15特異性的細胞毒作用。結果不同HBV抗原基因rAAV-HBV-S、C、E、X 轉染DC后CD14、CD80、CD83、CD86的表型表達中，CD80、CD83差異有統計學意義(P<0.05)；rAAV/HBV-X轉染的DC其CD80表達最高，rAAV/HBV-S轉染的DC其CD83表達最高。轉染不同HBV抗原基因片段rAAV(S、C、E、X)的DC誘導的CTL對MHC-Ⅰ類抗原陽性且有HBV的靶細胞(HepG2.2.15)的特異性殺傷效率顯著高于對無HBV的靶細胞(HepG2)的非特異性殺傷效應(P<0.01)，但不同rAAV-HBV組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論rAAV-HBV-S、C、E、X轉染DC均可誘導CTL引起MHC-Ⅰ依賴的特異性細胞毒效應。

肝炎病毒，乙型；樹突細胞；T淋巴細胞，細胞毒性；人主要組織相容性復合物；腺相關病毒

慢性乙型病毒性肝炎的治療目前仍然是臨床醫師面臨的重大挑戰，主要的藥物有核苷(酸)類藥物和干擾素兩大類[1]；前者雖然具有較好的抑制病毒復制的作用，卻由于血清學應答率容易復發而難以停藥，后者雖然血清學應答優于前者，但抗原轉陰和轉換率仍然不理想[2-3]。因此，尋求新的方法以期實現滿意以至理想的治療終點一直是近年來臨床工作者追求的目標[4]。本研究旨在比較以腺相關病毒(adenovirus associated virus,AAV)2型為載體，攜帶不同乙型肝炎基因片段S(C基因型)、C、E、X即重組腺相關病毒(rAAV-HBV-S,C,E,X)感染樹突狀細胞(DCs)誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的細胞毒效應,為慢性乙型肝炎免疫治療提供理論依據。

1　材料與方法

1.1主要試劑及重組腺相關病毒GM-CSF、IL-4、TNF-α等細胞因子購自美國Peprotech公司，AIM-V培養基購自美國Gibco公司。人HBV-S、E、C和X抗體購自美國Chemicon公司，熒光FITC標記二抗及同型對照購自美國BD公司。rAAV-HBV-S、E、C、X病毒由美國阿肯色州立醫科大學基因治療中心劉勇教授惠贈，其構建、擴增和純化均在阿肯色州立醫科大學基因治療中心完成，病毒滴度可以達到107copy/mL以上。靶細胞人肝癌細胞系HepG2及HepG2.2.15細胞株購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。HepG2.2.15細胞是在HepG2細胞轉染了HBV基因并穩定表達HBV的細胞株。

1.2主要儀器流式細胞儀(FACS,美國Millipore公司)，高速離心機(美國Thermo公司)，酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3研究對象與靶細胞人主要組織相容復合物Ⅰ類分子(MHC-Ⅰ)HLA配型按照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，經過倫理委員會同意,在知情同意的基礎上選取重慶三峽中心醫院18～60歲e抗原陽性的慢性乙型病毒性肝炎住院患者為研究對象，排除甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎，藥物性肝炎，重型乙型肝炎和肝癌。抽取患者的外周血分離單個核細胞與實驗靶細胞(HepG2及HepG2.2.15細胞)進行MHC-Ⅰ類抗原位點檢測配型。

1.4DC的分離培養和轉染rAAV-HBV-S、E、C和X用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMCs)后，將細胞重懸于AIM-V培養基中，于六孔培養板中37 ℃，6% CO2培養3 h，將未貼壁細胞用PBS輕洗后用含有重組IL-2(終濃度為20 U/mL)的AIM-V培養基重懸后以2×106/孔加入到六孔板中用于T細胞(CTL的前期細胞)體外誘導擴增，隔日換半量換液備用。在貼壁細胞中每孔分別加入100 μL重組rAAV-HBV-S、E、C和X病毒(按照每1×108細胞加入200 μL的比例，MOI相當于400)感染細胞，同時在AIM-V培養基中加入900 U/mL GM-CSF于37 ℃，6%CO2，過夜培養。病毒感染后第1天，將細胞培養上清液去除。隔天半量更換培養液，同時加入GM-CSF(終濃度為900 U/mL)和IL-4(終濃度為1 000 U/mL)。在培養第5天加入10 ng/mL TNF-α,培養第7天收獲細胞。

1.5rAAV-HBV-S、E、C和X重組病毒感染DC的檢測流式細胞儀間接熒光法檢測DC內HBV相應抗原的表達：將感染的DC經PBS洗滌3次后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，750 r/min離心5 min，棄上清液；將穿透劑(含1% BSA，0.1%皂素，0.24% Hepes的PBS)按每1×106個細胞加入1.5 mL的比例加入，室溫作用15 min后離心棄上清液。在細胞沉淀中加入10 μL抗HBV相應抗體室溫閉光標記60 min，洗滌后加FITC標記的二抗，再用穿透劑洗滌一次，500 μL的PBS重懸細胞，上機檢測。

1.6DC成熟狀態的檢測將收獲的兩組細胞用PBS 洗滌兩遍后,1 200 r/min離心5 min,棄上清液,細胞沉淀用50 μL含1% 胎牛血清的PBS 重懸。細胞管中加入抗CD14-FITC、抗CD80-CY5各20 μL,在細胞管中加入抗CD83-FITC,抗CD86-CY5各20 μL,同時做一管FITC/PE/CY5三標同型對照,閉光標記30 min后,各管分別加入3 mL PBS洗滌兩遍,1 200 r/min,離心5 min,棄上清液,細胞沉淀用500 μL PBS重懸,上機檢測。

1.7DC誘導CTL在6孔板內，以AIM-V為培養基，參照前期實驗及文獻[5]研究報道按DC∶T =1∶20的比例混合DC和T細胞．同時加入IL-2(終濃度為100 U/mL)以及IL-7(終濃度為40 U/mL)共培養，每隔1天半量換液，以充分誘導激活特異性的CTL。

1.8四甲基偶氮唑鹽(MTS)法分析HBV特異性的CTL 殺傷作用使用CellTiter 96 AQerous One Solution Cell Proliferation Assay 試劑盒，收獲HBV抗原特異性AAV激活的成熟CTL，并按照20∶1(前期研究結果最佳效靶比)將其與靶細胞(轉染HBV基因的HepG2.2.15細胞或無HBV的HepG2細胞)混合并接種于96孔板中，置于37 ℃，6%CO2培養箱中。孵育6 h后，加入MTS試劑，再置于37℃，6%CO2培養箱孵育1 h后，使用酶標儀讀取波長為570 nm的吸光度(A)值，計算殺傷率。殺傷率(%)=[1-(實驗孔A值-效應孔A值)/靶細胞孔A值]×100%。

1.9流式細胞儀間接熒光細胞內染色檢測HBV目的基因的表達分別使用4種攜帶不同HBV抗原的AAV感染單核細胞，使用AIM-V培養基、GM-CSF、IL-4、TNF-α等試劑將其在7 d內誘導為成熟的DC細胞，收獲DC細胞，進行流式胞內檢測處理后，使用流式細胞儀檢測4種HBV抗原的表達率。

2　結　果

2.1HLA配型靶細胞(HepG2及HepG2.2.15細胞)與慢性乙型肝炎患者外周血進行MHC-Ⅰ成功配型，保證被激活的CTL細胞特異性殺傷靶細胞具有嚴格的MHC-Ⅰ型限制性。

2.2DC細胞的體外培養分離出的PBMCs于AIM-V培養液中培養4 h即有部分細胞貼壁，經rAAV-HBV感染刺激后，在含有GM-CSF/IL-4/TNF-α的AIM-V培養液中，單核細胞向DC分化及成熟。各實驗組AAV感染組在細胞形態及細胞數量上差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3不同rAAV感染DC效率FACS檢測感染DC中熒光標記的陽性細胞內HBV-S、C、E、X相應抗原的表達，分別為86.87%、85.03%、89.51%和89．40%，各組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　攜帶不同HBV基因片段腺相關病毒感染效率(%)

2.4DC細胞表型的檢測攜帶不同乙肝病毒抗原的rAAV感染外周血單核細胞后，在含有GM-CSF/IL-4/TNF-α的AIM-V培養液中，單核細胞向DC分化及成熟。在培養后第6天，流式分析收獲DC的表型CD14、CD80、CD83、CD86，組間CD80和CD83的表達差異有統計學意義(P<0.05)，其中CD80以rAAV-HBV-X為最高，CD83以rAAV-HBV-S最高，見表2和圖1。

表2　攜帶不同HBV基因片段腺相關病毒對DC的表型和功能的影響

圖1流式細胞儀檢測不同HBV基因片段腺相關病毒轉染DC對其表型的影響

2.5不同rAAV-HBV轉染DC 誘導的CTL特異性的細胞毒效應rAAV-HBV-S、C、E、X轉染DC誘導的CTL特異性的殺傷靶細胞HepG2.2.15(表達HBV抗原的靶細胞)與對照組HepG2(不表達HBV抗原的靶細胞)相比均差異有統計學意義(P<0.01)，但不同基因片段之間對HepG2.2.15靶細胞的殺傷作用差異無統計學意義(P>0.05),見圖2和表3。

圖2　攜帶乙型肝炎基因片段的rAAV轉染DC誘導的CTL對靶細胞的殺傷效應

靶細胞HBV?SHBV?EHBV?CHBV?XPHepG2．2．1553．01±12．1652．02±6．9951．06±5．3958．90±2．920．4141HepG211．30±7．818．95±2．737．39±1．399．67±1．680．5592

3　討　論

乙型肝炎是一個免疫相關性疾病，其中樹突狀細胞在HBV清除與慢性化中扮演了重要角色。以乙型肝炎疫苗負載的DC治療乙型肝炎有一定的效果[6-7]；但由于疫苗作為蛋白質抗原半衰期短、降解快，刺激DC不充分而效果不理想，如果用HBV基因片段轉染樹突狀細胞誘導CTL治療慢性乙型病毒性肝炎，有可能克服乙型肝炎疫苗負載DC刺激不充分的缺點[8-10]。

AAV是一種安全和穩定的載體，已被美國FDA宣布為最安全、最理想的病毒載體[11]；以負載腫瘤基因的AAV在腫瘤治療上已有較多的研究[12-14]。文獻[15-16]已證明經擴增純化的攜帶HBV的C基因片段的重組AAV能高效轉染DC，并促進其成熟和功能表達，也能刺激CTL引起細胞的毒效應。本研究進一步比較了攜帶HBV S、C、E、X 4種基因片段的重組AAV轉染DC后誘導CTL的細胞毒效應。不同rAAV刺激DC表型表達有一定差異，其中CD80和CD83差異有統計學意義，其中CD80以rAAV-HBV-X為最高，CD83以rAAV-HBV-S最高。

盡管在刺激DC表型的表達上攜帶不同HBV基因片段的rAAV-HBV-S、C、E、X之間差異有統計學意義，但4種抗原基因均能誘導CTL的特異性殺傷效應，4組間差異無統計學意義。提示4種基于重組腺相關病毒轉染樹突狀細胞的治療慢性乙型肝炎技術均可能成為治療慢性乙型病毒性肝炎的新方向，有必要進行臨床研究進一步評價。

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Study on the killing effect of cytotoxic T lymphocytes induced by dendritic cells transduced recombinant adenovirus associated virus with different hepatitis B virus gene fragment*

An Xuan1,Liu Yong2,Xiang Yi1,Wei Fang1,Xia Lina1,Zhong Qing1,Du Biao1,Wu Guicheng1△

(1.ChongqingThreeGorgesCentralHospital,Chongqing404000,China;2.Gene&BiotherapyCenter,UniversityofArkansasforMedicalSciences,LittleRock,Arkansas72205,USA)

ObjectiveTo compare the killing effect of cytotoxic T lymphocytes(CTLs) induced by dendritic cells transduced recombinant adenovirus associated virus(rAAV)with different hepatitis B virus gene fragment(rAAV-HBV-S,C,E,X).MethodsPeripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from chronic hepatitis B patients were isolated and transduced recombinant adeno-associated virus with different hepatitis B virus (HBV) antigen gene fragment (rAAV-HBV-S,C,E,X),then GM-CSF,IL-4 and TNFα were added to cultivate for 7 days to generate mature dendritic cells (DCs).The state of DCs were observed and differentiation antigen molecules (CD)were detected by flow cytometry(FACS)to evaluate their maturation and function.Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) were induced by the mixed cuture of DCs with prepared T lymphocytes.HepaG2.2.15 and HepaG2 were targed cells and the killing effect of CTLs wered compared using MTS assay.ResultsThe expression of phenotype CD14,CD80,CD83,CD86 from DCs transduced with rAAV-HBV-S,C,E,X were compared,respectively.Of which,CD80,CD86 were significantly different(P<0.05).CD80 in group rAAV-HBV-X was the highest,and CD83 in group rAAV-HBV-S was the highest.Cytotoxic effect of CTL induced by DC transduced with HBV antigen gene fragment of rAAV (S,C,E,X) to target cells with HBV (HepG2.2.15 cells) were significantly higher than that of without HBV target cells (HepG2 cells) (P<0.01),but the four groups were no significant difference,respectively(P>0.05).ConclusionHBV-S,C,E,X genes all induce MHC-I dependently cytotoxic T-lymphocytes specific response based adeno-associated virus (AAV) vector delivery into dendritic cells.

hepatitis B virus;dendritic cells;T-lymphocytes,cytotoxic;major histocompatibihity complex;adeno-associated virus

重慶市自然科學基金資助項目(csts2012jjA10110)。作者簡介：安選(1978-)，主治醫師，碩士，主要從事各種肝病的研究?！?/p>

，E-mail:351094703@qq.com。

R392.12

A

1671-8348(2016)27-3745-03

2016-04-18

2016-07-06)