PCR檢測貴州遵義地區(qū)蝙蝠B(yǎng)DV-P40基因片段及同源性分析

雷以會，徐　平，楊利玲

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563000)

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PCR檢測貴州遵義地區(qū)蝙蝠B(yǎng)DV-P40基因片段及同源性分析

雷以會，徐平，楊利玲

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563000)

目的探討貴州遵義地區(qū)蝙蝠是否存在博爾納病毒(BDV)自然感染，分析比較其與國外標準株的同源性。方法采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測82只蝙蝠額顳葉腦組織中BDV-P40基因片段，將陽性擴增產(chǎn)物測序，與國外標準株比較同源性。結(jié)果蝙蝠額顳葉腦組織中BDV-P40基因片段陽性率為12.2%(10/82)。貴州遵義地區(qū)蝙蝠自然感染的BDV-P40核苷酸序列與標準株Strain V和H1766同源性均為96.2%，與He/80比對同源性為94.9%，所編碼的氨基酸無改變。結(jié)論貴州遵義地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染，該地區(qū)BDV-P40核苷酸序列與Strain V和H1766存在高度同源性，人感染BDV可能為動物源性。

博爾納病毒；實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)；蝙蝠；BDV-P40基因片段

1885年，在德國Saxony州Borna鎮(zhèn)的戰(zhàn)馬中爆發(fā)流行一種以精神、行為異常為特征的致死性腦炎，此病被命名為博爾納病(borna disease,BD)，隨后研究者們在病馬腦組織中分離出了致病病原體，并命名為博爾納病毒(BDV)。由于受到地域的限制和典型病例的消失，BDV很長一段時間未受到科學(xué)界的重視。以往，學(xué)者們認為BDV僅局限于德國和瑞士的地方流行區(qū)的畜牧場動物和部分野生動物。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，研究發(fā)現(xiàn)BDV具有廣泛宿主范圍，除了馬、羊，在大鼠、沙鼠、駱駝、恒河猴、鹿、馬、牛、貓、山羊、兔、綿羊、狗、羊駝、小鼠等中也均發(fā)現(xiàn)存在BDV自然感染，由此可以推斷BDV可以感染包括人在內(nèi)的所有恒溫動物[1]。20年來的研究發(fā)現(xiàn)，BDV廣泛存在于人類疾病中，如精神分裂癥、病毒性腦炎、多發(fā)性硬化等，同時越來越多的國家及地區(qū)也檢出該病毒，BDV引發(fā)了科學(xué)界的重視[2]。

課題組成員前期工作中用巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR(fluorescence quantitative nested polymerase chain reaction,FQ-nRT-PCR)檢測貴州及周邊地區(qū)的山羊、牛的外周血淋巴細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中BDV-P24基因片段，陽性率分別為0.67%、4.17%，說明該地區(qū)存在BDV自然感染。有研究證實，蝙蝠是狂犬病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒等多種病毒的潛在宿主，可以成為一些人畜共患病的傳播媒介[3-4]。由于蝙蝠具有長距離飛行的能力，部分還具有遷徙性，可能會促進病毒傳播，造成病毒的爆發(fā)流行。

蝙蝠是否也是BDV的自然感染宿主之一，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本實驗采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對蝙蝠額顳葉腦組織BDV-P40基因片段進行檢測，對陽性產(chǎn)物進行測序，與國外的標準株進行比對分析，分析貴州省BDV的流行病學(xué)特征及變異，為進一步研究打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物82只蝙蝠來源于貴州省遵義市(未對蝙蝠的種類、雌雄及年齡等作區(qū)分)，采集時間為2014年5～9月。每只取同側(cè)新鮮額顳葉腦組織約250 mg，分裝在去RNA酶的EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2主要試劑Trizol RNA提取試劑購自上海Intrivegen;PCR試劑盒購自美國Promega;BDV-P40引物由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心提供，序列見表1。

表1　　BDV-P40引物序列

1.1.3主要儀器分光光度計NanoDrop ND-1000購自美國Thermo公司；PTC-200 DNA Engine Cycler、Rotor Gene 6000 series Software 1.7購自澳大利亞Corbett Research公司；Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；去RNA酶硅化耗材購自美國Axygen公司。

1.2方法

1.2.1腦組織RNA提取吸取1 mL Trizol加入去RNA酶的EP管中，取蝙蝠腦組織100 mg置入其中，研磨腦組織至勻漿液，再加入氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s，靜置5 min，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，取上清液。加入等體積的異丙醇混勻后靜置10 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液。晾干后加入1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液控干后溶解于適量的DEPC水中，所提取的RNA在分光光度計下測OD260/280值及濃度，選取10個樣本RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察樣本RNA的完整性，分裝并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,根據(jù)不同樣本的RNA濃度計算RNA的加樣量(VRNA=500 ng/CRNA)，加DEPC水至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3RT-PCR檢測BDV-P40基因片段GoTaq?qPCR Master Mix(2×)10.0 μL、P40上游引物0.4 μL、P40下游引物0.4 μL、DEPC 7.2 μL、cDNA 2.0 μL，充分混勻后在熒光定量PCR儀上進行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、58 ℃ 45 s，循環(huán)45次。每次反應(yīng)均做無模板對照，排除假陽性，同時以BDV陽性的cDNA(由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心提供)做陽性對照，排除假陰性結(jié)果。

1.2.4RT-PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，將目的條帶處于78 bp處的標本視為陽性，將陽性標本送往上海英俊生物公司純化、克隆及測序。

1.3分析將測序結(jié)果與國外標準株Strain V、H1766和He/80進行同源性分析比較。

2　結(jié)　　果

2.1RNA純度和完整性檢測82只標本所測得的OD值在1.89～2.08，說明純度較好；1%瓊脂糖凝膠電泳觀察到3個條帶，分別為28S、18S、5S，其中28S條帶的亮度是18S的2倍，說明RNA完整性較好，可以用于后續(xù)研究。

2.2RT-PCR檢測BDV-P40基因片段采用RT-PCR對蝙蝠腦組織中BDV-P40基因片段進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10只標本為陽性，陽性率為12.2%(圖1)。陽性標本1%瓊脂糖凝膠電泳，樣本目的條帶與陽性對照在同一位置(圖2)。

圖1　　　　　RT-PCR檢測蝙蝠腦組織BDV-P40

2.3陽性PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果及同源性的分析將蝙蝠B(yǎng)DV-P40陽性標本的測序結(jié)果輸入美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)系統(tǒng)進行比較分析，證實本次實驗所擴增的片段為BDV-P40(nt548-625)的基因片段，與人類基因組及其他病毒基因無同源性。BDV-P40陽性標本測序結(jié)果與Strain V和H1766的同源性均為96.2%，有3個位點出現(xiàn)一致性沉寂突變(nt548G>T，nt550T>G，nt553A>T)，突變率為3.8%，但所編碼的氨基酸無改變；與He/80比對同源性為94.9%，有4個位點出現(xiàn)一致性沉寂突變(nt548G>T，nt550T>G，nt553A>T，nt609T>C)，突變率為5.1%。雖然貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織中的BDV-P40基因片段與國外標準株比對存在堿基突變，但所編碼的氨基酸無改變，見圖2～4。

1～10：陽性標本;+：陽性對照。

圖2陽性標本1%瓊脂糖凝膠電泳

〔〕：BDV-P40陽性PCR產(chǎn)物核苷酸序列。

圖3蝙蝠腦組織中檢測出的BDV-P40 cDNA克隆核苷酸序列測序結(jié)果

紅色標示：突變堿基。

圖4蝙蝠腦組織經(jīng)PCR擴增后目的基因片段序列測定結(jié)果與 BDV Strain V、He/80、H1766 核苷酸序列及氨基酸序列比較

3　討　　論

BDV為未分段的單分子負鏈RNA病毒，直徑為90 nm，為封套狀、球形的感染顆粒[5]。BDV有6個開放閱讀框架，至少能夠指導(dǎo)編碼6種病毒蛋白，包括核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白、非糖基化的特殊蛋白和RNA依賴的RNA聚合酶[6]。其中編碼P24、P40的序列較為保守、變異性小，從而成為檢測BDV-RNA的特異性標志物。其中BDV-P40核酸及核蛋白在被感染細胞中含量較為豐富，且BDV-P40基因片段的特異性高，變異程度最小，為檢測BDV自然感染的重要依據(jù)之一[7]。

BDV是一種非細胞溶解性、嚴格嗜神經(jīng)性病毒，容易造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的持續(xù)感染。BDV也是惟一在細胞核內(nèi)復(fù)制的單分子負鏈RNA病毒，從而對于BDV感染診斷的金標準是在腦組織中分離出該病毒。但在實際工作中腦組織來源較少，且操作復(fù)雜、成功率低，使得此項工作無法順利開展。何豐等[8]采用FQ-nRT-PCR法對新疆伊犁地區(qū)牧羊犬的腦組織及PBMC BDV進行檢測，其中腦組織BDV陽性率為9%，PBMC陽性率為5%，雖然腦組織BDV陽性率高于外周血，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Nakamura等[9]從1例精神分裂癥患者腦組織中分離出了BDV，但該患者PBMC中并未檢出BDV核酸，故外周血中BDV核酸陰性并不能完全排除患者存在BDV感染。

冰島是一個對動物進出口要求非常嚴格的國家，檢測范圍包括BDV，但Bjornsdottir等[10]首次在該地區(qū)馬群中發(fā)現(xiàn)BDV相關(guān)抗體，推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能的原因是遷徙的候鳥。最近有學(xué)者在美國的加拿大鵝中體內(nèi)分離得出1株新的BDV序列，推測此類遷徙的水鳥能長距離攜帶該病毒[11]。也有人提出，沿遷徙候鳥路徑分布的馬廄中的馬有較高的BDV檢出率[12]。據(jù)統(tǒng)計蝙蝠體內(nèi)可分離出80多種病毒，且蝙蝠種類繁多，在自然界分布廣泛，喜群居、壽命長、善飛行等特點為病毒傳播創(chuàng)造便利，蝙蝠在新發(fā)病毒傳播及流行中起著重要角色。而隨著人類城市的不斷擴張，越來越多蝙蝠可長期定居于城市中，人們與蝙蝠的接觸也逐漸增多，由此帶來公共衛(wèi)生問題不得不引起關(guān)注。

本研究采用RT-PCR檢測組82只蝙蝠腦組織BDV-P40陽性率為12.2%。BDV-P40 PCR陽性產(chǎn)物測序與國外標準株Strain V、H1766比對同源性為96.2%，有3個位點發(fā)生堿基互換(nt548G>T，nt550T>G，nt553A>T)；與He/80比對同源性為94.9%，有4個位點發(fā)生堿基互換(nt548G>T，nt550T>G，nt553A>T，nt609T>C)。本研究證實了貴州遵義地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染，該地區(qū)感染的BDV-P40核苷酸序列與Strain V、H1766存在高度同源性。BDV是一種特殊的RNA病毒，其RNA具有高度保守性，從而保證了遺傳的穩(wěn)定性。蝙蝠腦組織中檢出的BDV-P40基因片段雖存在部分堿基突變，但所編碼的氨基酸序列未發(fā)生改變。

新型病毒的不斷爆發(fā)流行，無疑給經(jīng)濟建設(shè)及社會安寧帶來了嚴重的影響。近來的中東呼吸綜合征，因其致死率高于非典型肺炎(SARS)，引起了人們極度的恐慌，同時也敲響了世界必須對新發(fā)病毒感染性疾病的進行實時監(jiān)控的警鐘。本研究證實了貴州地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染，但因缺乏從該地區(qū)動物或人腦組織分離出來的病毒株，對該地區(qū)蝙蝠自然感染BDV的來源尚無法做全面的解釋。因此，尚需做進一步的調(diào)查研究，揭示該地區(qū)BDV的流行病學(xué)特征，為防止BDV的爆發(fā)流行打下基礎(chǔ)。

[1]Lipkin WI,Briese T,Hornig M.Borna disease virus - Fact and fantasy[J].Virus Res,2011,162(1/2):162-172.

[2]Bechter K.Updating the mild encephalitis hypothesis of schizophrenia[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2013,42(S1):71-91.

[3]Sendow I,Ratnawati A,Taylor T,et al.Nipah virus in the fruit bat pteropus vampyrus in sumatera,Indonesia[J].PLoS One,2013,8(7):e69544.

[4]Field H,De Jong C,Melville D,et al.Hendra virus infection dynamics in Australian fruit Bats[J].PLoS One,2011,6(12):e28678.

[5]Kinnunen PM,Palva A,Vaheri A,et al.Epidemiology and host spectrum of Borna disease virus infections[J].J Gen Virol,2013,94(Pt 2):247-262.

[6]Schindler AR,Vogtlin A,Hilbe M,et al.Reverse transcription real-time PCR assays for detection and quantification of Borna disease virus in diseased hosts[J].Mol Cell Probes,2007,21(1):47-55.

[7]Watanabe M,Zhong Q,Kobayashi T,et al.Molecular ratio between borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA[J].Microbiol Immunol,2000,44(9):765-772.

[8]何豐，馮裕星，孫后超，等．牧羊犬外周血和腦組織博爾納病病毒檢測結(jié)果的比較[J]．中國人獸共患病學(xué)報，2010，26(4)：337-340．

[9]Nakamura Y,Takahashi H,Shoya Y,et al.Isolation of borna disease virus from human brain tissue[J].J Virol,2000,74(10):4601-4611.

[10]Bjornsdottir S,Agustsdottir E,Blomstrom AL,et al.Serological markers of Bornavirus infection found in horses in Iceland[J].Acta Vet Scand,2013,55(1):77.

[11]Payne S,Covaleda L,Guo JH,et al.Detection and characterization of a distinct bornavirus lineage from healthy Canada geese (branta canadensis)[J].J Virol,2011,85(22):12053-12056.

[12]Pitlik S,Teplitsky V,Richt JA,et al.Increased prevalence of Borna disease virus elisa and immunofluorescent antibodies in horses from farms situated along the paths of migratory birds[J].Israel J Veterinary Med,2003,58(2):80-85.

PCR detection on the P40 gene fragment of borna disease virus in bats and its homology analysis in Zunyi area of Guizhou province

LeiYihui,XuPing,YangLiling

(DepartmentofNeurologyAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi,Guizhou563000,China)

ObjectiveTo investigate whether the bat in Zunyi region of Guizhou province exist Borna disease virus(BDV) natural infection,and to explore the homology with the foreign standard virus strains.MethodsBDV-P40 in frontal and temporal lobe brain tissue of 82 bats were detected with real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),the BDV-P40 positive samples were sequenced and compared with the foreign standard virus strains.ResultsThe BDV-P40 positive rate was 12.2%(10/82)in frontal and temporal lobe brain tissue of bats.After sequence comparison,BDV-p40 fragment of the nucleotide sequence in Strain V,H1766 showed 96.2% homology,He/80 exhibited 94.9% homology,but there were no change in the encoding amino acid residues.ConclusionThe bats in Zunyi region of Guizhou province exist latent infection of BDV,and the positive BDV-P40 nucleotide sequence is highly homologous with strain V and H1766,human infection with BDV may be a source of animals.

borna disease virus;real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction;bat;P40 gene fragment of BDV

雷以會(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.006

R741.02

A

1671-8348(2016)25-3475-03

2016-03-18

2016-06-06)

論著·基礎(chǔ)研究