磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的異源表達(dá)

湯先澤，劉　偉，皮雄娥，尹業(yè)師，王　欣，劉新利，*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

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磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的異源表達(dá)

湯先澤1，劉偉2，皮雄娥2，尹業(yè)師2，王欣2，劉新利1，*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

根據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏好性，在不改變編碼蛋白的基礎(chǔ)上，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成枯草芽孢桿菌磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因，將其與大腸埃希菌-乳酸乳球菌穿梭質(zhì)粒pAMJ399連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAMJ399-PIPLC，并電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示：重組蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外，分子質(zhì)量約35 ku，與預(yù)期蛋白大小一致。重組蛋白在PI-李斯特氏菌顯色平板上顯現(xiàn)明顯的乳白色暈圈，證明重組蛋白具有酶活性，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)在重組乳酸乳球菌中成功獲得表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，以2%轉(zhuǎn)接量，在含有1%紅霉素抗性的GM17液體培養(yǎng)基中，于32 ℃靜止培養(yǎng)24 h，測(cè)得培養(yǎng)基上清液中PI-PLC的濃度為1.092 μg·mL-1。

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C；克隆表達(dá)；乳酸乳球菌；GPI錨定蛋白

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)的種類很多，在細(xì)菌、原生動(dòng)物、酵母、霉菌、植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中均存在。PI-PLC的一個(gè)典型特點(diǎn)是：細(xì)菌PI-PLC是可分泌酶，而其他生物體內(nèi)的PI-PLC是胞內(nèi)酶。細(xì)菌PI-PLC是一個(gè)小型的、具有晶體結(jié)構(gòu)的水溶性酶[1]，可以催化水解磷酸肌醇磷酸二酯鍵，產(chǎn)生水溶性肌醇磷酸鹽(1-磷酸肌醇，InsP；1，4-二磷酸肌醇，InsP2；1，4，5-三磷酸肌醇，InsP3)以及脂溶性二酰基甘油(DAG)[2]。在高等真核生物中，PI-PLC是參與大多數(shù)受體介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶[3]。研究表明，多種激素、藥物和生物活性物質(zhì)與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，均會(huì)活化胞內(nèi)Pl-PLC?；罨腜l-PLC可將細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phoshatidylinsitol-4，5-bisplioshate，PIP2)水解為DAG和InsP3，兩者作為第二信使，繼續(xù)向胞內(nèi)傳遞調(diào)節(jié)代謝的信息：DAG活化蛋白激酶C(PKC)，InsP3動(dòng)員鈣庫(kù)釋放Ca2+?；罨腜KC與Ca2+協(xié)同作用，調(diào)節(jié)多種生理功能，如平滑肌和骨骼肌收縮、離子通道變化、血小板聚集、激素分泌、免疫細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生等[4-6]。

近年來(lái)，細(xì)菌酶PI-PLC的研究熱點(diǎn)主要集中在其具有裂解細(xì)胞膜表面糖基(GPI)錨定蛋白方面的能力。細(xì)菌酶PI-PLC可裂解細(xì)胞膜表面糖基(GPI)錨定蛋白，從而影響細(xì)胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的釋放，而大多數(shù)致病性寄生蟲(chóng)細(xì)胞膜表面抗原蛋白都是通過(guò)糖基錨定在細(xì)胞膜上的，PI-PLC能切斷GPI錨定蛋白中肌醇磷脂與細(xì)胞膜的連接，使寄生蟲(chóng)喪失入侵宿主細(xì)胞和在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的能力[7-10]。因此，細(xì)菌酶PI-PLC顯示出顯著的抗感染特性。故對(duì)PI-PLC抗感染作用的研究，以及大量生產(chǎn)PI-PLC進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用的研究現(xiàn)已成為生物化學(xué)和生化藥理學(xué)研究的熱門(mén)課題。

微生物來(lái)源PI-PLC較其他來(lái)源具有生產(chǎn)周期短、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，但大多數(shù)產(chǎn)PI-PLC的菌株都具有病原性[11-12]，在食品安全性方面存在一定的隱患。乳酸乳球菌是一群能大量發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值很高，屬公認(rèn)的安全微生物[13]。

本研究根據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏好性，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成枯草芽孢桿菌磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因，并以其作為模板，利用乳酸乳球菌P170表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PI-PLC基因。該系統(tǒng)由pH值和生長(zhǎng)周期調(diào)控，不需要添加外源性的誘導(dǎo)物，并能高效提升蛋白分泌的水平[14-15]。另外，乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，酸不僅可以誘導(dǎo)P170啟動(dòng)子表達(dá)，而且酸性環(huán)境還可以提高PI-PLC的表達(dá)量及酶活性[16]。外源蛋白通過(guò)分泌表達(dá)后，無(wú)須純化與復(fù)性等繁瑣的操作過(guò)程，拓寬了其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用[17]。因此，本研究初步嘗試?yán)迷撏緩綄?shí)現(xiàn)PI-PLC基因的異源高效表達(dá)，為后續(xù)的工作提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒

大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；乳酸乳球菌MG1363及分泌型表達(dá)質(zhì)粒pAMJ399，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2酶及相關(guān)試劑

高保真聚合酶2×super HIFI-MIXⅡ購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BsaⅠ，BglⅡ，SalⅠ，DNA marker，T4 DNA連接酶等購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒、pEASY-T1 Cloning kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PI-PLC ELISA kit購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；氨芐青霉素、紅霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其他主要試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

乳酸乳球菌GM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基，0.5%葡萄糖)，培養(yǎng)條件為32 ℃，靜止培養(yǎng)24 h；乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化復(fù)蘇培養(yǎng)基SGM17(10 mL M17，1 526 μL 50%蔗糖，200 μL 50%葡萄糖，100 μL 2 mol·L-1MgCl2，40 μL 0.5mol·L-1CaCl2)；大腸埃希菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r·min-1，12 h。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA操作技術(shù)

質(zhì)粒提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、連接、轉(zhuǎn)化等均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1.2.2目的基因的設(shè)計(jì)與合成

查閱文獻(xiàn)資料，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中得到一段蠟狀芽孢桿菌PI-PLC基因(GenBank∶M30809.1)。根據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏好性，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成PI-PLC目的基因。目的基因由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成

利用Vector NTI基因分析軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物：上游引物P1，5’-GGCGGTCTCAGATCTTCTAACAAAAAACTTATCCTGAAA-3’，由于目的基因本身含有BglⅡ酶切位點(diǎn)，因此在BglⅡ酶切位點(diǎn)前加入BsaⅠ酶切位點(diǎn)，下劃線分別為BsaⅠ，BglⅡ酶切位點(diǎn)；下游引物P2，5’-GGCGTCGACTTATTCTTTGATTAAGGATT-3’，下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn)。引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4PI-PLC基因的克隆

以合成的PI-PLC基因?yàn)槟０澹訮1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×super HIFI-MIXⅡ25 μL，滅菌的雙蒸水20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個(gè)循環(huán)；之后，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.2.5克隆載體pEASY-T1-PIPLC的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收，與pEASY-T1克隆載體相連，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆，用M13 forward primer和M13 reverse primer引物進(jìn)行菌落PCR，鑒定陽(yáng)性重組子。將鑒定為陽(yáng)性的重組子命名為pEASY-T1-PIPLC，并接入LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg·mL-1)培養(yǎng)，送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.6重組大腸埃希菌表達(dá)載體的構(gòu)建

由于直接將目的基因和表達(dá)載體連接，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化構(gòu)建乳酸乳球菌表達(dá)載體比較難，且pAMJ399質(zhì)粒是大腸埃希菌-乳酸乳球菌穿梭質(zhì)粒，因此，先進(jìn)行大腸埃希菌表達(dá)載體的構(gòu)建。將pEASY-T1-PIPLC克隆載體和pAMJ399載體分別經(jīng)BsaⅠ，SalⅠ以及BglⅡ，SalⅠ雙酶切、膠回收，獲得帶有粘性末端的目的片段，16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含紅霉素(300 μg·mL-1)的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選，37 ℃，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子用P1，P2引物進(jìn)行菌落PCR，挑取擴(kuò)增出目的大小片段的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，正確的重組質(zhì)粒命名為pAMJ399-PIPLC，將獲得的重組大腸埃希菌命名為pAMJ399-PIPLC/Trans1-T1，并進(jìn)行甘油管保藏。

1.2.7重組乳酸乳球菌表達(dá)載體的構(gòu)建

將提取的重組質(zhì)粒pAMJ399-PIPLC電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG1363，電轉(zhuǎn)化儀參數(shù)設(shè)置為：電壓2.0 kV，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊時(shí)間4.5～5.0 ms，電擊后加入SGM17培養(yǎng)基，32 ℃，靜止復(fù)蘇2 h后，將復(fù)蘇的菌液涂布于GM17(含有紅霉素1 μg·mL-1)固體培養(yǎng)基，32 ℃厭氧培養(yǎng)20 h，挑取轉(zhuǎn)化子用P1，P2引物進(jìn)行菌落PCR，挑取擴(kuò)增出目的大小片段的轉(zhuǎn)化子接種于GM17(含有紅霉素1 μg·mL-1)液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，32 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜。將獲得的重組乳酸乳球菌命名為pAMJ399-PIPLC/MG1363，并將其進(jìn)行甘油管保藏。

1.2.8重組菌在乳酸乳球菌中的表達(dá)及SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)

挑取陽(yáng)性重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363單菌落接種于5 mL GM17(含有紅霉素1 μg·mL-1)液體培養(yǎng)基，32 ℃靜置培養(yǎng)20 h后，按1∶50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)。取1 mL菌液于12 000 r·min-1離心10 min，上清通過(guò)TCA的方法進(jìn)行10倍濃縮，沉淀用溶菌酶處理。將處理好的上清和沉淀與2×SDS加樣緩沖液混合后煮沸10 min，12 000 r·min-1離心3 min，取20 μL進(jìn)行SDS-PAGE(12%分離膠，5%濃縮膠)電泳分析，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量為參考，并以同樣方法處理的pAMJ399/MG1363乳酸乳球菌作為對(duì)照。

1.2.9PI-PLC的酶活力測(cè)定

磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C及其他磷脂酶類一般采用熒光法測(cè)定酶活[18]，但是由于測(cè)試底物昂貴，且步驟繁瑣耗時(shí)，本文采用PI-李斯特氏菌顯色平板法定性測(cè)定PI-PLC酶活力，其原理為PI-PLC水解磷酸肌醇磷酸二酯鍵，產(chǎn)生不溶于水的二?；视?，在平板上顯示為乳白色暈圈。取10 μL發(fā)酵液置于PI-李斯特氏菌顯色平板上，37 ℃溫育12 h，所產(chǎn)生的乳白色暈圈的大小即代表酶活力的高低。由于該方法磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C直接作用于底物磷脂酰肌醇，因此，操作簡(jiǎn)單便捷，且成本低廉，應(yīng)用較為廣泛。

2　結(jié)果與分析

2.1目的片段和克隆載體的獲得及鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 000 bp處有一條特異性條帶，大小與預(yù)期值相符(圖1)。按1.2.5節(jié)方法構(gòu)建克隆表達(dá)載體pEASY-T1-PIPLC，挑取白色單克隆進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 200 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶(如果載體直連，自連帶大小為199 bp)，大小與預(yù)期值相符(圖2)。對(duì)pEASY-T1-PIPLC上的PCR片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示目的基因全長(zhǎng)990 bp，與優(yōu)化設(shè)計(jì)的PI-PLC基因序列順序及大小一致。

2.2重組大腸埃希菌表達(dá)載體pAMJ399-PIPLC的鑒定

按1.2.6節(jié)方法構(gòu)建了重組大腸埃希菌表達(dá)載體pAMJ399-PIPLC(圖3)，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞T1中，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在1 000 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，大小與預(yù)期值相符，且對(duì)照菌沒(méi)有條帶(圖4)。提質(zhì)粒測(cè)序，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果為插入的目的片段序列，且酶切位點(diǎn)序列正確。

圖1　目的基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification result of the target gene

圖2　菌落PCR結(jié)果Fig.2　PCR amplification result of the colonies

2.3重組乳酸乳球菌表達(dá)載體的鑒定

挑取經(jīng)GM17(含有紅霉素1 μg·mL-1)平板篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果出現(xiàn)一條約1 000 bp大小的條帶，大小與預(yù)期值相符。

2.4重組質(zhì)粒在乳酸乳球菌中的表達(dá)

重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363經(jīng)SDS-PAGE分析后結(jié)果表明，重組菌的上清和沉淀經(jīng)電泳后，在上清中出現(xiàn)了約35 ku的蛋白條帶，與預(yù)測(cè)蛋白分子量大小相當(dāng)，且沉淀中沒(méi)有目的大小條帶，說(shuō)明重組蛋白是以可溶蛋白的形式分泌到胞外的。并且，對(duì)照菌的上清、沉淀均未出現(xiàn)目的大小條帶(圖5)。

2.5PI-PLC酶活性驗(yàn)證及酶聯(lián)反應(yīng)分析

取10 μL培養(yǎng)24 h的重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363的上清液點(diǎn)PI-李斯特氏菌顯色平板，并以同樣方法處理pAMJ399/MG1363乳酸乳球菌作為對(duì)照，37 ℃溫育12 h。結(jié)果顯示：重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363點(diǎn)板處出現(xiàn)乳白色暈圈，而對(duì)照沒(méi)有乳白色暈圈(圖6)。

應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定菌液中的PI-PLC水平。用純化的PI-PLC抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入PI-PLC，再與HRP標(biāo)記的PI-PLC抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的PI-PLC呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(D)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中PI-PLC的濃度。最終測(cè)得24 h后培養(yǎng)液中PI-PLC的濃度為1.092 μg·mL-1(圖7)。

圖3　表達(dá)載體pAMJ399-PIPLC的構(gòu)建Fig.3　Construction of expression vectors pAMJ399-PIPLC

1： 重組菌pAMJ399/MG1363(CK)；2： 重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363。圖4　菌落PCR結(jié)果Fig.4　PCR amplification result of the colonies

M： 蛋白marker；1： 重組菌pAMJ399/MG1363發(fā)酵液離心上清(CK)；2： 重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363發(fā)酵液離心上清；3： 重組菌pAMJ399/MG1363發(fā)酵液離心沉淀(CK)；4： 重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363發(fā)酵液離心沉淀。圖5　SDS-PAGE電泳圖Fig.5　Electrophoretogram of SDS-PAGE

1： 重組菌pAMJ399-PIPLC/MG1363發(fā)酵液離心上清；2： 重組菌pAMJ399/MG1363發(fā)酵液離心上清(CK)。圖6　重組蛋白活性驗(yàn)證Fig.6　Verification of recombinant enzyme activity

圖7　PI-PLC標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7　Standard curve line of PI-PLC product

3　討論

對(duì)細(xì)菌PI-PLC基因結(jié)構(gòu)及酶功能的研究始于國(guó)外20世紀(jì)80年代[1，19]，該酶所特有的裂解GPI錨定蛋白的能力是目前研究的主要熱點(diǎn)之一。GPI錨定蛋白將糖基化磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜表面，PI-PLC能切斷GPI錨定蛋白中肌醇磷脂與細(xì)胞膜的連接，釋放細(xì)胞膜表面上錨定的糖蛋白和碳水化合物[20]。GPI錨定機(jī)制在原生動(dòng)物和高等真核生物中普遍存在。在原生動(dòng)物細(xì)胞膜表面，GPI錨定似乎已被選定為表面蛋白錨定最有效的形式。有證據(jù)表明，一些寄生蟲(chóng)的特異性GPI錨定結(jié)構(gòu)是寄生蟲(chóng)得以在昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物等宿主中生存、增殖、感染所必不可少的機(jī)制。因此，以細(xì)菌PI-PLC酶作為抗寄生蟲(chóng)藥物來(lái)進(jìn)行開(kāi)發(fā)及研究具有廣闊的前景[10]。然而目前國(guó)內(nèi)對(duì)相關(guān)方面的研究及報(bào)道很少。

本文根據(jù)乳酸乳球菌密碼子的偏好性，優(yōu)化設(shè)計(jì)并合成蠟狀芽孢桿菌PI-PLC基因，采用乳酸乳球菌-大腸埃希菌穿梭質(zhì)粒pAMJ399為表達(dá)載體，成功構(gòu)建重組乳酸乳球菌pAMJ399-PI-PLC/MG1363。利用P170啟動(dòng)子基于分子生物學(xué)途徑成功實(shí)現(xiàn)了PI-PLC基因在乳酸乳球菌中的可溶性表達(dá)，避免了包涵體復(fù)性帶來(lái)的各種麻煩。P170啟動(dòng)子是酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，乳酸乳球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，自身代謝產(chǎn)生乳酸，使培養(yǎng)基pH不斷下降，當(dāng)pH在5.5～6.5時(shí)，啟動(dòng)子具有活性，誘導(dǎo)表達(dá)載體開(kāi)始蛋白表達(dá)。這時(shí)正值菌體從指數(shù)生長(zhǎng)期過(guò)渡到平臺(tái)期，既不需要額外添加誘導(dǎo)物，又可將菌體生長(zhǎng)期與外源蛋白的生產(chǎn)期分開(kāi)[21]。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件， 2%轉(zhuǎn)接量，在含有1%紅霉素抗性的GM17液體培養(yǎng)基中，于 32 ℃靜止培養(yǎng)24 h，測(cè)得培養(yǎng)基上清液中PI-PLC的濃度為1.092 μg·mL-1。后續(xù)工作將利用其N(xiāo)端6-HIS標(biāo)簽將PI-PLC進(jìn)行分離純化，獲得的純酶將用于PI-PLC酶學(xué)性質(zhì)及其替代抗生素用來(lái)抗寄生蟲(chóng)效果方面的應(yīng)用研究，以期為PI-PLC的產(chǎn)業(yè)化及工業(yè)化應(yīng)用做出貢獻(xiàn)。

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(責(zé)任編輯高峻)

Cloning and heterologous expression in Lactococcus lactis of phosphatidylinositol-specific phospholipase C gene from Bacillus cereus

TANG Xian-ze1， LIU Wei2， PI Xiong-e2， YIN Ye-shi2， WANG Xin2， LIU Xin-li1，*

(1.SchoolofBioengineering，QiluUniversityofTechnology，Jinan250353，China; 2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Based on the codon bias ofLactococcuslactis， phosphatidylinositol-specific phospholipase C gene fromBacilluscereuswas optimized and then synthesized for protein expression. The cloned gene was inserted intoEscherichiacoli-Lactococcuslactisshuttle vector pAMJ399， and then transformed toL.lactiscells by electroporation to induce expression. The result of SDS-PAGE showed that the recombinant protein was secreted extracellular in the form of soluble proteins， and its molecular weight was about 35 ku， which was consistent with the expected protein size. Meanwhile， the recombinant protein showed significant enzyme activity on PI-Listeria chromogenic plate. The results indicated that phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC) was successfully expressed inL.lactis. The growth condition was optimized as follows: 2% inoculation amount; GM17 medium with 1% erythromycin; 32 ℃. After 24 h static culture under above condition， it could produce 1.092 μg·mL-1PI-PLC in the supernatant of culture medium.

phosphatidylinositol-specific phospholipase C; cloning and expression;Lactococcuslactis; GPI-anchored proteins

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.15

2016-01-26

國(guó)家“973”計(jì)劃子課題項(xiàng)目(2012CB721006)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目

湯先澤(1990—)，男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑幑こ?。E-mail: 1004302941@qq.com

，劉新利，E-mail: vip.lxl@163.com

Q939.9

A

1004-1524(2016)04-0640-07

湯先澤，劉偉，皮雄娥，等. 磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的異源表達(dá)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(4)： 640-646.