一株增香微生物的分離鑒定及其發酵產香條件優化

余　翔，李元實，劉　棟，王瑞停，帖金鑫，馬　林，*

(1. 鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002； 2. 吉林煙草工業有限責任公司 生產技術中心，吉林 延吉 133000； 3. 廣東中煙工業有限責任公司 技術中心，廣東 廣州 510385)

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一株增香微生物的分離鑒定及其發酵產香條件優化

余翔1，李元實2，劉棟3，王瑞停2，帖金鑫1，馬林1，*

(1. 鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002； 2. 吉林煙草工業有限責任公司 生產技術中心，吉林 延吉 133000； 3. 廣東中煙工業有限責任公司 技術中心，廣東 廣州 510385)

從14種煙葉表面篩選出一株能夠利用煙末發酵產香的菌株GXY35，通過生理生化實驗和16S rDNA序列對其進行分析，并用GC/MS對發酵液的香氣成分進行分析。結果表明：GXY35分離株屬于克雷伯氏桿菌，發酵液中特征香味物質4-乙烯基愈創木酚的含量最高。在單因素試驗的基礎上通過正交試驗，對菌株的發酵條件進行優化。結果表明，最適宜的產香發酵條件為：料液比1∶20，接種量12%，發酵溫度37 ℃，發酵時間72 h，pH值7.0。在此條件下，特征香味物質4-乙烯基愈創木酚的含量最高可達0.725 mg·mL-1。

生物香料；特征香味物質；發酵產香；卷煙香氣

近年來，國內外越來越多的煙草研究者對煙草香味物質進行研究，已經取得了很大的進展，但主要集中在以化學或者物理方法處理煙葉方面。此外，國內外也有一些關于利用微生物發酵或者酶促反應來改善煙葉總體質量的研究報道[1-9]，但多集中在煙葉感官質量和常規化學成分的變化上，對利用煙草廢料或廢棄煙末發酵增香的應用研究少有報道。趙銘欽等[10]研究了不同生物制劑處理對發酵烤煙煙葉中香氣物質含量的影響，結果表明：處理后的發酵煙葉中大多數香氣成分，如大馬酮、二氫大馬酮、紫羅蘭酮等，含量有一定的增加趨勢。通過利用烤煙葉面上存在著的微生物對煙葉進行發酵增香，可以定向增加煙葉的香氣，充分保持煙葉的原有品質。朱大恒等[11]提出了一種新型生產煙草香料的方法，直接利用產香微生物發酵煙葉制備生物香料。周瑾等[12]從優質烤煙葉上分離篩選得到一種優勢的微生物菌種，并將其接種于低等級烤煙煙葉的碎片上，測定發酵前后煙葉碎片化學成分的變化，結果發現，發酵后的低等級煙葉中，有機酸含量有一定程度的增加，還原糖含量明顯降低。研究表明：將發酵后的煙草廢料中提取到的香味物質，運用到卷煙加香評吸中，能夠明顯降低卷煙刺激性，增加卷煙香氣，掩蓋煙草雜氣，一定程度上可改善卷煙的吸食品質[13]。在烤后煙葉表面上存在著大量的微生物，本文擬從烤后煙葉表面篩選出能夠利用廢棄煙末發酵產香的微生物，對其進行分離鑒定，并優化增香微生物發酵產香的條件，旨在利用煙葉微生物發酵廢棄煙末加工生產出帶有煙草天然香韻的生物香料。

1　材料與方法

1.1材料與設備

發酵煙末為河南中煙工業有限責任公司廢棄煙葉；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等生化試劑，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈣、硫酸亞鐵、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂等試劑，均為分析純，購自天津大茂化學試劑廠。

SW-CJ-2D凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；LR56495型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher科技公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養箱，太倉市實驗設備廠；Veriti 96-Well Thermal Cycler型PCR儀，美國Applied Systems公司；MiniBIS Pro凝膠成像儀，以色列DNR成像系統有限公司；Leica DM750光學顯微鏡，德國徠卡微系統有限公司；T6新世紀型紫外可見分光光度計，北京普析儀器有限公司；感量0.000 1 g分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；HP6890/5976型GC/MS氣質聯用儀，美國惠普公司。

1.2試驗方法

1.2.1培養基配制

基礎培養基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，瓊脂粉20 g·L-1，pH值為7.2～7.4，0.1 MPa置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min。

篩選培養基：阿魏酸0.75 g，KH2PO40.9 g，Na2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，無菌水定容至1 000 mL，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃下滅菌30 min。

發酵培養基：按料液比1∶10在篩選培養基基礎上添加發酵煙末。

1.2.2菌株的分離純化

稱取5 g煙葉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL無菌水。37 ℃，200 r·min-1振蕩培養15～30 min。將菌液依次稀釋成10-1～10-7的濃度梯度，均勻涂布于含有基礎培養基的平板上，放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察平板菌株的生長情況，選擇最適濃度梯度。挑取出不同形態的單菌落，采用平板劃線法分離純化菌株，并編號保存。

1.2.3菌株的篩選

挑取一環純菌株，接入篩選培養基試管中，將試管置于恒溫振蕩培養箱中，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養24～48 h。取出后，在通風條件較好的環境下，觀察記錄分離菌株發酵液的外觀和香氣特征變化情況。

1.2.4菌株的鑒定

產香菌株的生理生化特性按照常規方法進行分析鑒定[14]。

另采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA，送交上海生物工程公司測序。PCR擴增使用通用引物，以27F作為上游引物，1492R作為下游引物。

1.2.5發酵液香味成分的分析及發酵條件優化

將產香菌接入不含瓊脂的基礎培養基中，37 ℃，150 r·min-1振蕩培養24 h。再按一定比例，將種子液接入發酵培養基培養72 h。用二氯甲烷萃取發酵液，收集有機相于三角瓶中，添加一定量無水硫酸鈉，4 ℃靜置過夜。加入1 mL乙酸苯乙酯作為定量分析的內標物質，經濃縮處理，得到1 mL淡黃色揮發性物質，進行GC/MS定性定量分析，確定其特征香味物質。通過3次重復單因素試驗探究料液比、發酵溫度、發酵時間、起始pH值以及微生物接種量對發酵液產香效果的影響，并用SPSS 19.0 軟件對各因素進行方差分析，同時通過正交試驗對其最佳發酵條件進行優化[15-16]。

2　結果與分析

2.1菌株的篩選分離及鑒定

從不同原材料中共分離出71株菌，其中18株對篩選培養基有產香效果，將其分別接入發酵培養基后，最終選出1株有明顯增香效果的菌種，編號為GXY35，發酵增香菌的生理生化鑒定結果見表1。PCR產物經連接、轉化，篩選陽性克隆和測序，得到長度為1 058 bp的序列，提交到GenBank，采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。結果發現，發酵增香菌GXY35與Klebsiellasp. SHN-1，Klebsiellasp. SFR-111，Klebsiellavariicolastrain XF13等克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)的菌株同源性均為99%，且其生理生化鑒定結果也與之符合，故將GXY35鑒定為克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)。

2.2發酵液特征香味成分分析

準確量取50 mL發酵液于圓底燒瓶中，再向其中加入300 mL蒸餾水和30 g NaCl，以60 mL二氯甲烷作為萃取劑，在60 ℃水浴中進行同時蒸餾萃取，結果如圖1。萃取150 min后，分離有機相，加入1 mL乙酸苯乙酯作為定量分析的內標物質，在60 ℃水浴中減壓濃縮，除去大部分有機溶劑，得到淡黃色揮發性物質。所得揮發性組分進行GC/MS分析。

表1菌株GXY35生理生化反應鑒定結果

Table 1Identification result of strain GXY35 by physiological and biochemical test

測試項目測試結果測試項目測試結果革蘭氏染色-V-P-鞭毛染色-淀粉水解-芽孢染色-硝酸鹽-伴孢晶體-吲哚-莢膜染色+石蕊牛奶+檸檬酸鹽+甲基紅M-R+葡萄糖產酸-明膠液化-

注：-為陰性； +為陽性。

采用同時蒸餾萃取方法，得到一個峰面積相對于其他成分較高的香味物質，通過質譜分析后，確定該香味物質成分為4-乙烯基愈創木酚(圖2)，并以4-乙烯基愈創木酚作為該產香菌株的特征發酵產香物質。

圖1　同時蒸餾萃取發酵液氣質色譜圖Fig.1　Temperament chromatogram of fermentation broth by SED

2.3菌株產香發酵條件優化

2.3.1發酵溫度對香味物質含量的影響

從圖3可以看出，溫度對微生物的生長及特征香味物質含量有顯著影響。發酵溫度過高或過低都不利于微生物的生長，在37 ℃時，香味物質累積量最大，說明微生物代謝能力在此時較強。

2.3.2起始pH值對香味物質含量的影響

在37 ℃下，測定菌株發酵產香的最適初始pH。由圖4可看出，當起始pH值為7.0時，特征香味物質的積累量達到最大。

2.3.3微生物接種量對香味成分的影響

由圖5可以看出，隨著微生物接種量的增加，發酵液香味物質含量也隨之增大。當接種量從8%提高到12%時，香味物質成分的含量顯著增加，但增幅不及之前。考慮到工業生產中的成本問題，因此選擇8%作為最適微生物接種量。

2.3.4料液比對香味成分的影響

控制料液比分別為1∶20，1∶12，1∶10和1∶8，向發酵液中添加煙末，在初始pH值7.0，微生物接種量8%，發酵溫度37 ℃條件下，發酵72 h，研究不同料液比對香味成分含量的影響，結果如圖6所示。隨著料液比的增大，菌株產香效果先穩步增加；但當料液比增大到1∶8時，特征香味物質含量顯著下降。這可能是由于較高的料液比下，不利于微生物與溶氧的充分接觸，降低了其代謝強度。綜合考慮，選擇1∶10為微生物發酵的最適料液比。

圖2　4-乙烯基愈創木酚與標準譜庫的對比Fig.2　Comparison between 4-vinylgualacol and the standard library of spectra

不同處理間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖3　發酵溫度對香味成分含量的影響Fig.3　Effect of fermentation temperature on content of aroma components

圖4　起始pH值對香味成分含量的影響Fig.4　Effect of pH on content of aroma components

2.3.5發酵時間對香味成分的影響

按1∶10的料液比向發酵液中添加煙末，在初始pH值7.0，微生物接種量8%，發酵溫度37 ℃條件下，分別發酵24，48，72，96 h，研究不同發酵時間對香味成分的影響情況。由圖7可知，隨著發酵時間延長，特征香味物質含量增加；但當發酵時間從72 h延長至96 h，香味物質含量增幅較小；且較長的發酵時間可能會造成發酵液中煙堿累積量增加，故選擇72 h為最適發酵時間。

圖5　微生物接種量對香味成分含量的影響Fig.5　Effect of inoculums size on content of aroma components

圖6　料液比對香味成分含量的影響Fig.6　Effect of solid-liquid ratio on content of aroma components

圖7　發酵時間對香味成分的影響Fig.7　Effect of fermentation time on content of aromacomponents

2.4產香發酵條件優化

根據單因素試驗結果，選取發酵溫度、起始pH值、接種量、發酵時間和料液比5個因素進行正交試驗，具體水平設置見表2。

正交試驗結果見表3。由表3可知，極差由大到小依次是A>D>B>C>E，表明各因素對香味物質含量的影響依次為溫度>發酵時間>起始pH>接種量>料液比，最佳組合為A3B3C4D3E1，即料液比1∶20，接種量12%，發酵溫度37 ℃，發酵時間72 h，起始pH值7.0。在此條件下，特征香味物質的含量最高，通過內標物質計算其準確含量，可達0.725 mg·mL-1。對正交試驗結果做方差分析，結果顯示，各因素中只有溫度對特征香味物質含量的影響達到顯著水平。

表2正交試驗因素水平表

Table 2Factors and levels in orthogonal array design

水平A:溫度/℃B:起始pHC:接種量/%D:發酵時間/hE:料液比水平1285.01241∶20水平2326.04481∶12水平3377.08721∶10水平4439.012961∶8

表3正交試驗結果

Table 3Results of orthogonal array design

試驗號ABCDE含量/(mg·mL-1)1111110.5202122220.5273133330.5524144440.3515212340.5376221430.3647234120.3478243210.3139313420.41110334310.72511331240.38112342130.53813414230.17114423140.10115432410.14116441320.112K10.4870.4090.3440.3760.424K20.3900.3550.3990.3480.349K30.5130.4290.3440.4810.406K40.1310.3290.4360.3170.343R0.3820.1000.0920.1640.081

3　討論

煙葉經過適當的發酵處理后，青雜氣明顯減弱，香氣突出較好，而油潤和光澤基本保持，煙葉品質有較明顯的改善，其煙葉等級也有相應的提升[17-18]。煙葉在發酵后，其葉片表面上仍然生存著一些優勢種群的微生物，即使在溫度高達70 ℃的條件下進行發酵，仍然會有一些微生物殘存于煙葉表面。本研究從陳化的煙葉表面篩選出一株發酵產香菌株GXY35，該菌株能夠利用廢棄煙末發酵生產制備煙草生物香料。通過常規形態學、生理生化反應以及16S rRNA序列分析對菌株進行鑒定，結果表明，GXY35分離菌株屬于克雷伯氏桿菌屬(Klebsiellasp.)。在研究料液比、接種量、發酵溫度、發酵時間和起始pH各單因素影響的基礎上，采用正交試驗，得出菌株GXY35產香的最佳發酵條件為：料液比1∶20，接種量12%，發酵溫度37 ℃，發酵時間72 h，起始pH值7.0。通過GC/MS圖譜分析可知，發酵液中主要的揮發性香味成分有：4-乙烯基愈創木酚、異戊酸、棕櫚酸、5-羥甲基糠醛、糠醇、2，3-二氫苯并呋喃、2-乙酰基吡咯等，相對含量以4-乙烯基愈創木酚的最高。在最佳發酵條件下，菌株產香的特征香味物質4-乙烯基愈創木酚的含量可以達到0.725 mg·mL-1。目前，國內少有利用廢棄煙末發酵制取煙用香料的研究報道，明紅梅等[19]利用芽孢桿菌發酵產香制備香曲，其產香物質每100 g樣品中僅含有1.710 mg愈創木酚，與其相比，GXY35菌株具有更高效的產香能力。利用GXY35菌株對廢棄煙末進行發酵制備生物香料，能夠產生4-乙烯基愈創木酚的特征香味物質成分，可以定向增加卷煙的香氣，還可為開發帶有煙草天然香韻的生物香料及在卷煙加工過程中增加香氣提供科學依據，且有望實現煙渣廢棄物的高附加值、無害化和資源化利用，降低卷煙生產資源的浪費，為煙草加工和煙草農業的綠色清潔生產提供技術支持。

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(責任編輯高峻)

Isolation and identification of an aroma-producing strain and optimization of its fermentation condition

YU Xiang1， LI Yuan-shi2， LIU Dong3, WANG Rui-ting2， TIE Jin-xin1, MA Lin1，*

(1.SchoolofFoodandBioengineering，ZhengzhouUniversityofLightIndustry，Zhengzhou450002，China; 2.ProductionandTechnicalCenter，JilinTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Yanji133000，China; 3.TechniqueCenter,ChinaTobaccoGuangdongIndustrialCo.,Ltd,Guangzhou510385,China)

An aroma-producing strain GXY35 was isolated from 14 kinds of tobacco leaves， and the aroma components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). The strain was identified asKlebsiellasp. from physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA. The content of 4-vinylgualacol in fermentation broth was the highest. On the basis of single factor test， the fermentation condition of strain was optimized by orthogonal experiment. The optimal fermentation condition was as follows: the solid-liquid ratio of 1∶20， the inoculums size of 12%， the fermentation temperature of 37 ℃， the fermentation time of 72 h， and the initial pH of 7.0. Under the optimal fermentation condition， the content of the characteristic favoring substance of 4-vinylgualacol was 0.725 mg·mL-1.

bioflavours; characteristic flavoring substances; aroma-producing fermentation; flavor compounds in cigarette

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.20

2015-08-07

余翔(1991—)，男，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為煙草生物技術。E-mail: yuxiang7455718@163.com

，馬林，E-mail: malindf@vip.sina.com

TS49

A

1004-1524(2016)04-0670-06

余翔，李元實，劉棟，等. 一株增香微生物的分離鑒定及其發酵產香條件優化[J]. 浙江農業學報，2016，28(4)： 670-675.