楊梅凋萎病菌侵染、傳播及樹體內分布規律

任海英，梁森苗，鄭錫良，戚行江，*，朱瀟婷，顏麗菊

(1. 浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021; 2.浙江省臨海市特產技術推廣總站，浙江 臨海 317000)

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楊梅凋萎病菌侵染、傳播及樹體內分布規律

任海英1，梁森苗1，鄭錫良1，戚行江1，*，朱瀟婷2，顏麗菊2

(1. 浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021; 2.浙江省臨海市特產技術推廣總站，浙江 臨海 317000)

為了制定有效的楊梅凋萎病防控措施，對凋萎病菌分生孢子侵染、傳播、病害周年發生動態及病菌在樹體內分布規律進行了研究。結果表明：2×101～2×106mL-1濃度范圍內的分生孢子溶液都能侵染楊梅致病，主要通過嫩枝的皮口及傷口侵入，有2個侵染高峰期分別是5月和6月中旬至7月中旬。凋萎病菌分生孢子周年均可捕捉到，5月中旬至6月中旬和8月底至10月中旬為兩個分生孢子捕捉高峰期。凋萎病周年都有新病枝出現，發病高峰期集中在9月中旬至11月初，在果園內海拔低、流水沖刷嚴重的位置先發病。周年內發病楊梅樹內擬盤多毛孢的分離菌株數及DNA拷貝數都是健康樹的2～6倍。凋萎病菌可以周年寄生在楊梅的整個樹體內，沒有明顯的菌量高峰期，嫩枝位置菌量最大。

楊梅凋萎??；異色擬盤多毛孢；小孢擬盤多毛孢；分生孢子

楊梅(Myricarubra)是我國南方特有的珍稀水果，果實甜酸適口，風味獨特，截至2013年全國楊梅栽培面積約35萬 hm2，年產量約120萬 t，已成為長江以南各省市果品發展的支柱產業，成為山區農民增收致富的主要途徑。凋萎病于2004年首先在浙江省發現，在福建、江西、廣西、廣東等地也有陸續發生。凋萎病是近年來危害楊梅產業的主要病害，首先引起楊梅部分嫩梢干枯，然后整株樹的嫩梢干枯數量逐漸增多，一般3～5年整棵樹就會死亡[1]。凋萎病發生后影響楊梅樹體對氮、鈣等營養元素的吸收和傳遞[2-3]，根際菌根活力降低[4]。凋萎病發病速度快、傳染力強，如不及時控制病害的傳播，必將嚴重威脅到楊梅產業的可持續發展。

楊梅凋萎病的病原菌為異色擬盤多毛孢(Pestalotiopsisversicolor)和小孢擬盤多毛孢(P.microspora)[1]，兩種真菌對營養的利用非常廣泛，20～30 ℃菌絲生長良好[5-6]。還能寄生于楊梅葉片引起葉斑病[7-8]。擬盤多毛孢屬真菌屬于子囊菌門，主要以內生菌的形式存在，也是重要的植物病原菌，引起多種植物病害，如茶輪斑病、枇杷灰斑病、咖啡輪斑病、蘋果葉斑病、番石榴果斑病、粗榧枯死病[9-14]等。

不同品種的楊梅對凋萎病抗性差異明顯，目前的主栽品種東魁是敏感品種[15]。溫度以及相對濕度能顯著影響凋萎病菌分生孢子的萌發及其侵染[16]。雖然凋萎病的綜合防治技術已經有報道[17]，但是有關凋萎病的流行規律及病菌在楊梅樹體內分布的研究較少。為此，我們就凋萎病的周年消長及傳播規律，病菌在楊梅樹體內的時間及空間分布；凋萎病菌分生孢子侵染濃度、擴散和傳播方式等進行了相關研究。以期為進一步探明病菌在樹體內的分布規律，研究病菌與楊梅的互作機制，以便為制定切實有效的防治措施提供依據。

1　材料與方法

1.1調查地點及時間

試驗選擇在瑞安市、天臺縣和臨海市的東魁楊梅果園，凋萎病發生率在5%左右。每個縣選定1個果園，品種為東魁，樹齡為15～20年。試驗時間為2012年1月至2014年12月。

1.2分生孢子侵染濃度、途徑及時期

1.2.1分生孢子侵染濃度

將純化后異色擬盤多毛孢(P.versicolor)XJ27和小孢擬盤多毛孢(P.microspora)YS26菌株產生的分生孢子用無菌水洗下[1]，用血球計數板法計數，按照1∶1比例配制成不同濃度的分生孢子混合懸浮液，配制濃度如下：2×101，2×102，2×103，2×104，2×105，2×106mL-1，采用葉痕傷口接種法[1]，接種后第5天調查發病病情級數及其發病枝條數，以確定分生孢子侵染濃度。每個分生孢子濃度接種20個枝段，統計發病率和病情指數[15]。

1.2.2分生孢子侵染途徑的觀察

按照1∶1比例配制楊梅凋萎病病原菌強致病力菌株XJ27和YS26的分生孢子混合溶液，濃度為2×105mL-1，備用。

選擇楊梅帶有嫩葉15～40 cm長的枝條，分別在當年生嫩葉片正面、反面及葉柄長度中間位置、厚實的老葉片正面、反面及葉柄長度中間位置、嫩枝5～40 cm長(綠色半木質化的)、老枝5～40 cm長(木質化的)進行接種，刺傷或者無傷，每處理20次重復。

傷口接種方法是葉片或者葉柄傷口用針刺10個孔，枝條用刀片割出5 mm左右的傷口，深達木質部，去掉皮層，每孔用移液器加入新配制的分生孢子懸浮液20 μL，無傷接種是在相應位置滴加等量分生孢子懸浮液，以滅菌水接種作為對照。接種后葉片放在培養皿內，吸水滅菌濾紙保濕。接種后的枝條培養在250 mL的三角瓶內的無菌水中，塑料袋套48 h保濕。接種材料置于25 ℃培養箱內飽和濕度下恒溫培養5 d，調查發病病情級數及其發病枝條數，統計發病率和病情指數[15]。

1.2.3分生孢子侵染時期確定

使用40 cm×20 cm的硫酸紙袋于楊梅新梢抽生之前3月底隨機選擇樹勢及病情一致的10棵楊梅樹，在每棵樹的東、西、南、北四個方位隨機選擇套袋800個，每隔15 d在東、西、南、北四個方位每棵樹每個方位去掉2個袋子，共去掉40個袋子，枝梢暴露15 d后再把袋子套回去。隨著新梢的不斷生長，更換不同規格的紙袋，實驗持續時間從2014年3月30日至2014年8月30日，當年12月初打開所有袋子調查枝梢發病率，袋子有破損的枝條不調查。一直套著袋子的枝梢為對照。

1.3分生孢子傳播規律

在臨海發生凋萎病的果園內，選擇發病程度輕(單株枝條發病率大約5%)、發病程度嚴重(單株枝條發病率大約25%)各3棵果樹以及完全沒有發病的3棵果樹(單株枝條發病率為0)作對照。楊梅樹冠滴水線處與樹冠中心位置一樣高(大約1.5 m高度)的東、西、南、北四個方位各懸掛涂抹凡士林的載玻片2片，從2013年的3月下旬開始至2014年的3月上旬結束，每15 d捕捉一次。40×10倍光鏡下鏡檢凋萎病菌分生孢子數量。整張載玻片的面積為12 cm2，仔細掃描觀察每張載玻片5 cm2內分生孢子數量，鏡檢面積占玻片面積1/2.4，換算為整張玻片上的分生孢子數量，計算不同發病程度的楊梅樹每次收集到的24個載玻片總共捕捉到的分生孢子數量。

1.4凋萎病的周年消長及傳播規律

1.4.1凋萎病周年消長

2013年3月底至2014年3月底每月調查2次。每果園采用5點取樣法每點選擇4棵樹，每個時間點3個果園共調查60株樹的凋萎病新出現的干枯枝條數量，老的干枯枝條不再統計。統計全年3個果園的不同時間總發生凋萎病枝條數量。

1.4.2凋萎病的周年傳播

2013年12月31日選擇臨海一典型楊梅園內山腳下發病嚴重的3棵相鄰的楊梅樹作為傳播源頭標記為1～3號，病情級數分別為7，9，9，病情級數標準參考任海英等[17]建立的方法，每棵樹的病情指數分級標準如下：0級指整個樹體沒有發病枝梢；1級指整個樹體的發病枝梢≤10%；3級指10%<發病枝梢占整個樹體的總枝梢數≤25%；5級指25%<發病枝梢占整個樹體的總枝梢數≤50%；7級指50%<發病枝梢占整個樹體的總枝梢數≤75%；9級指75%<發病枝梢占整個樹體的總枝梢數≤100%。相鄰樹體兩兩之間直線距離大約為4～5 m，選擇26棵楊梅樹并做好標記。選擇的樹體相互之間直線距離為20～25 m，并且調查病情級數，于2014年12月31日再次調查標記楊梅樹體的病情級數，分析凋萎病圍繞發病中心的周年傳播情況。

1.5楊梅樹體內病菌空間分布樣品采集

選擇發重病(整個樹體大約75%枝梢發病)、中等發病(整個樹體大約25%枝梢發病)和發病輕(整個樹體大約10%枝梢發病)的8年生東魁果園，從2013年5月至2014年3月每隔2個月進行取樣，每次每地取樣3棵樹，取樣位置從樹根部至主干(一次分支)、二次分枝、三次分支、四次分支、五次分支、六次分支、七次分支、頂端有病癥嫩枝和葉片。根、主干和各分支使用5 mm便攜式電鉆鉆孔取鋸沫，每部分樣品平均分成2份，稱取同等質量的葉片研磨成粉末，一份用來組織分離真菌菌株，一份用來分子檢測病菌相對數量。取完全沒有凋萎病的3棵健康楊梅樹樣品，作為對照，取樣方法同上。

1.6擬盤多毛孢真菌的分離純化

利用組織分離方法[18]分離純化楊梅樣品內的擬盤多毛孢真菌。每份樣品稱取10 g鋸沫，均勻播散在PDA培養基(青島日水生物技術有限公司)平板上。25 ℃培養3 d后分離純化真菌菌落，純化后菌落在12 h光照(1 000 μmol ·m2·s-1)12 h黑暗，25 ℃下培養誘導產生分生孢子，顯微觀察分生孢子，鑒定為擬盤多毛孢的菌株統計真菌菌落數。

1.7實時熒光定量PCR

利用楊梅凋萎病菌的檢測引物對Pvm1L/Pvm1R[19]，Pvm1L∶5′-GAAA TGACGCTCGAACAGGC-3′，Pvm1R∶5′-TGAAGAACGCAGCGAA ATGC-3′，進行楊梅凋萎病菌的菌量檢測。實驗程序參考任海英等[19]的方法。利用CTAB方法[20]提取10 μg樣品的基因組DNA，作為模板濃度稀釋到標準曲線范圍內(100～200 ng·μL-1左右)，按照TaKaRa SYBR Premix DimerEraserTM(Perfect Real Time，貨號RR091A)的熒光定量試劑盒選擇20 μL的體系說明進行操作。Real time PCR程序：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個循環。實時熒光定量PCR的每個樣品重復3次。得出每個樣品的Ct值，然后根據標準曲線計算出目標片段的拷貝數。

1.8數據統計處理

所有數據使用Excel 2003和DPS 9.5處理，顯著性差異使用Duncan新復極差法分析。

2　結果與分析

2.1分生孢子侵染濃度、途徑及時期

2.1.1分生孢子侵染濃度

在分生孢子濃度2×10～2×106mL-1范圍內都能引起接種枝條100%發病，但是發病程度有差異，2×10 mL-1的分生孢子引起的發病程度最輕，病情指數為1；2×102，2×103，2×104mL-1濃度范圍內的分生孢子引起的發病程度相同，病情指數都是3；2×105mL-1濃度及以上發病程度嚴重，病情指數在5以上(圖1)，與其他濃度的分生孢子溶液引起的病情指數差異顯著。由此可見，病原菌分生孢子濃度影響發病程度，在凋萎病的傳播蔓延過程中分生孢子單位密度是一個重要因素。

2.1.2分生孢子侵染途徑

凋萎病菌接種后發現，雖然病菌在嫩葉正面和反面、老葉的正面和反面、嫩葉和老葉的葉柄都能引起楊梅組織發病，但是病癥不是凋萎病癥，而是枯斑病癥，而且葉片比葉柄容易發病，嫩葉比老葉容易發病，反面比正面容易發病。傷口及無傷接種發病率有顯著性差異。凋萎病菌侵染嫩枝和老枝時都引起凋萎病癥，并且嫩枝有傷時最容易發病，發病率達到62%，嫩枝無傷時發病率25%，老枝有傷和無傷發病率較低，分別為15%和9%(表1)，各處理之間發病率都達到顯著性差異。由此可見，凋萎病菌主要是通過嫩枝的皮口及傷口侵入。

柱上短線代表平均值的標準誤，沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1　分生孢子濃度與凋萎病發生的關系Fig.1　The relationship between the concentration of conidia and the incidence of twig blight disease on bayberry

2.1.3侵染時間

沒拆袋的楊梅嫩枝凋萎病的發生率是35%。從2014年3月底至8月底凋萎病菌有2個侵染高峰期，分別是5月和6月中旬至7月中旬，其中5月1日至5月16日的時間段內，侵染率達到54.55%，5月16日—5月30日與6月15日—6月30日的侵染率相同，都是50%。7月30日至8月15日這段時間內侵染率降至最低，低至16.67%，但是8月15日至8月30日凋萎病侵染率又有升高，與3月底4月初相近，侵染率達到33.33%(圖2)。這說明在東魁楊梅的果實發育及成熟采摘期是楊梅凋萎病菌的主要侵入時期。

2.2分生孢子周年傳播規律

在楊梅果園中周年均可捕捉到分生孢子，發病的樹周圍收集的孢子量大于健康樹，發病程度嚴重的樹收集的量大于發病程度輕的樹(圖3)。有2個捕捉高峰期，第一個在當年的5月中旬至6月中旬，第二個在當年的8月底至10月中旬，其中發病嚴重的樹在當年的8月底捕捉到的分生孢子數量最多，捕捉量為458個。最少捕捉量出現在當年7月中旬、當年12月中旬至翌年3月中旬，發病輕及其健康的樹捕捉分生孢子數量少于15個，甚至沒有(圖3)。以上結果說明，楊梅樹凋萎病菌周年均可產生、釋放分生孢子。

表1凋萎病菌侵染楊梅的途徑

Table 1The infection way ofPestalotiopsispathogen on bayberry

接種部位接種方式病癥發病率/%嫩葉片正面無傷枯斑25e有傷枯斑47d嫩葉片反面無傷枯斑42d有傷枯斑79a嫩葉柄無傷枯斑0g有傷枯斑56c老葉片正面無傷枯斑6f有傷枯斑53c老葉片反面無傷枯斑28d有傷枯斑71a老葉柄無傷枯斑0g有傷枯斑8f嫩枝無傷凋萎25e有傷凋萎62b老枝無傷凋萎9f有傷凋萎15e

注：同列不同行數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

柱上沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的暴露開始時間分別是2014年的3月30日、4月15日、5月1日、5月16日、5月30日、6月15日、6月30日、7月15日、7月30日、8月15日，持續時間為15 d。圖2　楊梅嫩枝暴露時間與凋萎病發病率的關系Fig.2　The relationship between the exposed time of bayberry shoots and disease incidence of twig blight disease

2.3凋萎病的周年消長及傳播規律

2.3.1病害周年消長規律調查

從3個縣的3個果園的60株樹的周年調查結果(圖4)可以看出：每月都有新病枝出現，出現的高峰期在當年的9月中旬至11月初。9月和10月新生病枝占全年的45.5%。周年中當年12月至翌年3月病枝增長數量少于其他月份，一年后楊梅凋萎病嚴重程度大幅度增長，調查果園病株的平均病枝數從1.6個增加到54.5個(圖4)。這說明凋萎病病枝出現在秋季的楊梅樹上明顯多于其他季節，而且樹體一旦發病，如果沒有有效防治措施，病情會迅速惡化。

圖3　楊梅凋萎病菌分生孢子周年傳播規律Fig.3　The anniversary spread of the conidia of Pestalotiopsis spp. on bayberry

圖4　浙江楊梅凋萎病周年消長規律動態Fig.4　The anniversary dynamic of twig blight disease of bayberry in Zhejiang Province

2.3.2凋萎病的周年傳播情況

按照圖5的空間分布發現，凋萎病發病有明顯的中心源，發病最早最嚴重的位置是果園內海拔最低、小路下側流水沖刷最嚴重的樹體，初次調查的中心源頭1號樹由病情7級上升為9級，兩棵9級病情的樹勢衰弱更加嚴重，頻臨死亡。距離1，2，3號樹體25 m左右的19號樹體病情由7級發展至9級。距離中心50 m左右的20號樹體病情略微有加重。其他海拔高度相近的4，5，6，7，8，21，22，23水平直線距離在150 m內的樹體都由0病級發展為1級。海拔高度20～30 m范圍內距離中心源較近的位置有兩個亞中心源，分別是10，11號和15，16，17號，其中距離中心源較近的10號和15號病情發展較快，周年后從病情2級和1級分別發展至7級和3級，而11，16，17號病情沒有明顯惡化。但是圍繞亞中心，周年后凋萎病有明顯外延，12，13，18號都由健康樹體變為1級病情。隨著海拔高度繼續升高，海拔30 m以上的樹體，距離中心源直線距離也增加50 m以上，凋萎病尚未發生(圖5)。這說明凋萎病有中心發病源，而且發病中心在果園內海拔低、流水沖刷嚴重的位置，外延傳播首先在海拔高度相似、直線距離相近的位置，然后才沿著高海拔的位置不斷攀升，周年傳播非?？欤^直線距離100 m，多點發病后，傳染源不斷疊加，傳播能力增強。

2.4不同發病程度楊梅樹體內擬盤多毛孢菌周年總分離情況

健康樹與不同發病程度的組織分離和實時熒光定量的樹體內擬盤多毛孢含量趨勢是一致的。健康楊梅樹分離的擬盤多毛孢菌株數明顯少于凋萎病發病植株，發病嚴重的樹體分離的菌株數顯著多于中等發病及輕發病的樹體，但是發病中等及輕的樹體分離菌株的數量沒有顯著性差異。健康樹周年分離的菌落數約300個，中等發病及輕發病的樹體周年分離菌落數大約是健康樹的2倍，發病嚴重的樹體分離的菌落數約是健康樹的3倍(圖6)。

實時熒光定量PCR檢測擬盤多毛孢菌株在1 μg楊梅鋸沫內的DNA拷貝數，健康楊梅組織內的擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數為8.7×105，輕病、中等發病及重病的楊梅樹內擬盤多毛孢的DNA拷貝數分別是健康樹的3，5和6倍(圖7)。

圖5　凋萎病的周年傳播情況Fig.5　The anniversary spread of twig blight disease

圖6　周年楊梅樹體內擬盤多毛孢菌株分離數Fig.6　Colony number of isolated Pestalopsis spp. from bayberry plants throughout the year

2.5楊梅樹體的不同位置擬盤多毛孢菌分布

楊梅樹體每個位置的10 g鋸沫分離擬盤多毛孢菌株的克隆數都大于6個，其中健康楊梅樹分離的菌株數在6～38個，總體低于發病楊梅樹分離的菌株數量，發病楊梅樹每個取樣位置分離菌株的數量在7～325個不等。發病楊梅樹根部分離的擬盤多毛孢菌株數最少，占整株樹分離量的1.10%～1.81%，嫩枝位置分離量最多，占整株樹分離量的35.64%～38.65%。其他主干及各分支分離菌量各占整株樹分離量的5.10%～9.21%(圖8)。這說明擬盤多毛孢菌株引起的楊梅凋萎病是系統性病害，并且在嫩枝位置菌量最大。

圖7　周年楊梅樹體內擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數Fig.7　DNA copy number of Pestalopsis spp. from bayberry plants throughout the year

圖8　楊梅樹體不同位置擬盤多毛孢菌株分離數Fig.8　Colony number of the isolated Pestalopsis spp. from the different parts of bayberry plants

1 μg楊梅樹體不同位置的樣品擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數的趨勢與菌株分離數的趨勢是一致的，健康樹的擬盤多毛孢DNA拷貝數為(0.01～12.73)×104，總體低于發病樹的菌株DNA拷貝數，發病樹的每個位置樣品擬盤多毛孢DNA拷貝數為(3.32～215.23)×104。發病楊梅樹根部擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數最少，占整株樹樣品總量的1.89%～8.01%，嫩枝位置菌株DNA拷貝數最多，占整株樹樣品總量的40.47%～72.04%。其他主干及各分支菌株 DNA各占整株樹樣品菌株DNA量的0.97%～17.64%(圖9)。這也說明擬盤多毛孢菌株引起楊梅凋萎病后，是系統性病害，并且在嫩枝位置菌量最大。

2.6周年不同時間楊梅樹體內擬盤多毛孢菌分布

從菌株分離數量來看，健康的楊梅樹樣品周年分離菌株數量變化不大，少于發病楊梅樹，范圍在31～62個，每次樣品分離菌量占全年樣品總量的11.7%～23.4%，發病的楊梅樹周年分離菌量變化較大，范圍在57～247個，每次樣品分離菌量占全年樣品總量的8.57%～27.08%。發病重、中等及輕的楊梅樹沒有明顯一致的分離高峰時間(圖10)。這說明擬盤多毛孢病菌周年都可以在楊梅樹體內存活。

從擬盤多毛孢菌株的DNA拷貝數來看，健康楊梅樹內菌株的周年變化較小，并且低于發病楊梅樹，1 μg楊梅樣品內菌株的DNA拷貝數是(1.12～1.46)×105個，每個時間段重病楊梅樹的菌株DNA拷貝數都多于中等發病及輕發病的，菌株DNA拷貝數為(3.9～20.68)×105。發病楊梅樹在9月份有1個一致的DNA拷貝數高峰，重病、中等及輕發病的DNA拷貝數量分別占到全年的31.25%，49.19%和51.21%，其他時間段浮動較大，分別占到全年DNA拷貝數的6.2%～21.35%(圖11)。這也說明擬盤多毛孢病菌周年都可以在楊梅樹體內存活。

圖9　楊梅樹體不同位置擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數Fig.9　DNA copy number of Pestalopsis spp. in the different parts of bayberry plants

圖10　不同時間楊梅樹體內擬盤多毛孢菌株分離數Fig.10　Colony number of the isolated Pestalopsis spp. from bayberry plants at different time

圖11　不同時間楊梅樹體內擬盤多毛孢菌株DNA拷貝數Fig.11　Colony number of Pestalopsis spp. in the bayberry plants at different time

3　討論

病菌侵染高峰期(第1個是當年的5月，第2個是當年的6月中旬至7月中旬)、病菌分生孢子釋放高峰期(第1個在當年的5月中旬至6月中旬，第2個在當年的8月底至10月中旬)及病害發生高峰期(當年的9月中旬至11月初)，從時間先后分析，凋萎病菌利用前年的分生孢子完成第一個侵染高峰，釋放大量分生孢子，這是第一個分生孢子釋放高峰，這些當年產生的分生孢子進行再侵染，完成病菌的第2次侵染高峰，隨即又產生大量的分生孢子，完成分生孢子的第2個釋放高峰。2次侵染高峰疊加起來，與其他時間段的侵染進行累加，到9月份發病的相對濕度及溫度適合、樹體生長勢放緩時，凋萎病才大面積出現癥狀。

楊梅凋萎病分生孢子的侵染高峰期最早出現在5月，而發病高峰期出現在9月及以后，病害潛伏期長達4個多月，降雨和溫度是主要的影響因素，這與蘋果輪紋病、炭疽病和黑星病等相似[21-22]。楊梅凋萎病菌主要通過嫩枝上的傷口侵入，自然孔口為次，這與桉樹焦枯病病原菌不同，后者主要以自然孔口為主[23]。氣溫、葉片濕度、雨量等綜合系統影響分生孢子的產生、萌發、侵染及植物的發病程度[24-25]。離體研究發現：溫度、相對濕度對楊梅凋萎病菌分生孢子的萌發及侵染有顯著影響[16]，但是果園內氣溫、葉片濕度及雨量等綜合系統對楊梅凋萎病菌分生孢子的萌發、侵染及楊梅發病程度的影響有待深入研究。

分生孢子的密度與病害嚴重度的關系在其他植物病原真菌病害有報道[25]，病害防治不是依賴病癥出現及環境條件，而是根據分生孢子的密度或者一特定密度的分生孢子出現后的時間(天數)來確定藥劑防治的時間。本研究結果也顯示，分生孢子密度會影響發病程度。由于本研究屬室內離體試驗結果，如何根據果園內捕捉分生孢子的量來決定防治方案尚需要進一步深入的研究。

植物病害的大面積流行與栽培品種、樹齡、土壤、氣候等因素有一定的關系[26]。本研究中凋萎病周年能夠發病，有發病高峰期，這與蘋果腐爛病相似，但是高峰期時間不一樣[27]，發病情況明顯受到季節和氣候因素及立地條件的影響，這與很多植物真菌病害相似[21-23，28]。與非周年發病的病害相比，很可能是由于病菌寄生位置及致病機理的差異[23，28]。

楊梅凋萎病菌的分生孢子周年都可以傳播，有傳播高峰，這與蘋果腐爛病相似，但是不同之處是楊梅凋萎病分生孢子的傳播高峰期有2個，而蘋果腐爛病只有一個分生孢子的傳播高峰期[27]。蘋果輪紋病、蘋果炭疽病及櫻桃褐斑病菌的分生孢子不是周年釋放的[22，28]。楊梅凋萎病發生嚴重的分生孢子釋放量大于發病程度輕的以及同果園內表現健康的，這與油菜褐斑病病情越重釋放分生孢子的量越多相似[25]。溫度和相對濕度能相互作用影響分生孢子的產生[25]。油菜褐斑病分生孢子的釋放在相對濕度大于87%的時候受溫度的影響，溫度越高越容易釋放[25]，芒果畸形病病原菌(Fusariummangiferae)的釋放在相對濕度低于55%時更容易收集到分生孢子[29]。降雨量影響子囊孢子的捕捉量[30]。楊梅凋萎病菌分生孢子的釋放傳播高峰期與其他時間相比，明顯受到溫度、相對濕度及降雨量的影響，但是具體變化閾值尚不明確，需要進一步研究。

分生孢子傳播距離及擴散效率與溫度、氣流、降雨量、季節及晝夜變化等都有關系[31-34]，本研究也表明楊梅凋萎病菌分生孢子的傳播受到雨水及風的影響。楊梅凋萎病的傳播有中心及近距離先傳到的特點，但是山坡的海拔、風向、溫度、降雨量、季節及晝夜等因素對分生孢子傳播及擴散的具體影響尚需要深入研究。

發病楊梅樹的擬盤多毛孢菌株在樹體內的數量多于健康楊梅樹體內菌量，病菌在樹體內是系統性周年存在的。迄今為止，未見有關擬盤多毛孢菌量的快速增殖以及增殖后引起的結果可能是引起植物發病原因的報道。美國佛羅里達粗榧(Torreyataxifolia)持續發生枯死主要是由于小孢擬盤多毛孢(P.microspora)真菌長期以內生的方式存在于佛羅里達粗榧的樹皮中，該真菌可以產生毒素毒害植物，導致大量佛羅里達粗榧出現全株枯死[14]，小孢擬盤多毛孢由內生變為產生毒素的病原菌的原因尚未知。

本研究發現，發病楊梅樹的擬盤多毛孢菌株在樹體內的分布并不均勻，根部、主干、葉片等位置分布少，但是嫩枝位置菌量最大，在柑橘黃龍病上也存在病菌分布不均勻的情況。染黃龍病的柑橘植株的根、莖、花、果、葉、根中均可檢測到黃龍病菌，但是病原菌的分布不均勻，果柄中含量最大[28，35-37]，而且有明顯黃龍病癥狀的樣品更容易檢測出黃龍病菌[28]。楊梅也是有凋萎病癥的更容易檢測到凋萎病菌[19]，而果實、種子、花等是否攜帶凋萎病菌，尚有待深入研究。根據楊梅病菌主要定殖在嫩枝位置，主干及根部病菌量較少的特點，可以鋸掉受侵染較重的部位，及時涂抹傷口保護劑，及時噴施防效好的殺菌劑，促使抽生健康枝梢，這在凋萎病的防治上已經取得了一定成效[17]。

[1]REN H Y， LI G， QI X J， et al. Identification and characterization ofPestalotiopsisspp. causing twig blight disease of bayberry (MyricarubraSieb. & Zucc) in China[J].EuropeanJournalofPlantPathology， 2013， 137(3): 451-461.

[2]鄭錫良， 任海英， 徐云煥， 等. 凋萎病對楊梅的氮吸收和分配的影響[J]. 中國南方果樹， 2013，42(1): 64-66.

[3]鄭錫良， 任海英， 徐云煥， 等.凋萎病對楊梅樹體鈣吸收和分配的影響[J]. 浙江農業科學， 2013 (2): 183-185.

[4]任海英， 方麗， 戚行江， 等. 枝葉凋萎病對楊梅根際菌根的影響[J]. 浙江農業學報， 2012， 24(1): 81-84.

[5]REN H Y， LI G， LIANG S M， et al. Effects of culture media， carbon and nitrogen sources and environmental factors on mycelial growth and sporulation ofPestalotiopsismicrosporastrains， the agent of bayberry twig blight in southern China[J].AsiaLifeSciences， 2013， 22(2): 713-727.

[6]任海英， 李崗， 戚行江， 等.楊梅凋萎病菌異色擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisversicolor)的生物學特性研究[J]. 浙江農業學報， 2013， 25(6): 1309-1320.

[7]孫化田， 曹若彬.寄生果樹上的擬盤多毛孢屬真菌的鑒定[J]. 浙江農業大學學報， 1990(增刊2): 179-185.

[8]孫化田，陳國貴，曹若彬.中國擬盤多毛孢屬四個新組合種[J]. 浙江農業大學學報， 1990(增刊2): 151-154.

[9]葛起新，陳育新，徐同.中國真菌志，擬盤多毛孢屬[J].北京：科學出版社， 2009.

[10]賀春萍， 鄭肖蘭， 李銳， 等.紅毛丹灰斑病病原菌鑒定及生物學特性研究[J]. 果樹學報， 2010， 27(2): 270-274.

[11]陳長卿， 張博， 楊麗娜， 等. 越橘圓斑病病原菌鑒定及其生物學特性[J]. 東北林業大學學報， 2011， 39: 95-98.

[12]張小媛， 何紅， 胡漢橋， 等. 紅海欖赤斑病病原菌鑒定及其生物學特性研究[J]. 植物病理學報， 2009， 39 (6): 584-592.

[13]KEITH L M， VELASQUEZ M E， ZEE F T. Identification and characterization ofPestalotiopsisspp. causing scab disease of guava，Psidiumguajava， in Hawaii[J].PlantDisease， 2006， 90(1): 16-23.

[14]LEE J C， YANG X S， SCHWARTZ M， et al. The relationship between an endangered North American tree and an endophytic fungus[J].ChemistryandBiology， 1995， 2(11): 721-727.

[15]張振蘭， 朱蕭婷， 任海英， 等. 楊梅種質資源對凋萎病抗性評價[J]. 浙江農業科學， 2014 (10): 1567-1569， 1571.

[16]任海英， 戚行江， 梁森苗， 等.環境因子對楊梅凋萎病菌分生孢子萌發及侵染的影響[J]. 果樹學報， 2015， 32(3): 474-480.

[17]任海英， 戚行江， 梁森苗， 等.楊梅凋萎病綜合防治技術試驗[J]. 浙江農業科學， 2014(12): 1849-1855.

[18]方中達. 植病研究方法[M].3版. 北京: 中國農業出版社， 1998.

[19]任海英， 戚行江， 梁森苗， 等.利用常規PCR和實時熒光定量PCR檢測楊梅凋萎病菌[J]. 植物病理學報， 2016， 46(1):1-10 .

[20]SAGHAI MAROOF M A， BIYASHEV R M， YANG G P， et al. Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity， chromosomal locations， and population dynamics[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 1994， 91(12):5466-5470.

[21]胡小平， 楊家榮， 田雪亮， 等.渭北旱塬蘋果黑星病流行因子分析[J]. 中國生態農業學報， 2007， 15(2): 118-121.

[22]吳桂本， 劉傳德， 王培松， 等.蘋果輪紋病和炭疽病發生規律的研究[J]. 萊陽農學院學報， 2000， 17(2): 86-92.

[23]鄭美珠.桉樹焦枯病發病規律的研究[J]. 福建林學院學報， 2006， 26(4): 339-343.

[24]GONZALEZ-DOMINGUEZ E， ARMENGOL J， ROSSI V.

Development and validation of a weather-based model for predicting infection of loquat fruit byFusicladiumeriobotryae[J].PLoSONE， 2014， 9(9): e107547.

[25]KHAN J， QI A， KHAN M F R. Fluctuations in number ofCercosporabeticolaconidia in relationship to environment and disease severity in sugar beet[J].Phytopathology， 2009， 99(7):796-801.

[26]李有忠， 宋曉斌， 張學武.獼猴桃細菌性潰瘍病發生規律研究[J]. 西北林學院學報， 2000， 15(2): 53-56.

[27]杜戰濤， 李正鵬， 高小寧， 等.陜西省蘋果樹腐爛病周年消長及分生孢子傳播規律研究[J]. 果樹學報， 2013， 30(5): 819-822.

[28]程保平， 鹿連明， 彭埃天， 等. 柑橘多個品種和多個部位中黃龍病菌的檢測與調查[J]. 廣東農業科學， 2014 (11): 69-72.

[29]劉保友， 張偉， 欒炳輝， 等.大櫻桃褐斑病病原菌鑒定與田間流行動態研究[J]. 果樹學報， 2012， 29(4): 634-637.

[30]GAMLIEL-ATINSKY E， SZTEJNBERG A， MAYMON M， et al. Inoculum availability and conidial dispersal patterns ofFusariummangiferae， the causal agent of mango malformation disease[J].Phytopathology， 2009， 99(2):160-166.

[31]ROSSI V， CAFFI T， LEGLER S E. Dynamics of ascospore maturation and discharge inErysiphenecator， the causal agent of grape powdery mildew[J].Phytopathology， 2010， 100(12): 1321-1329.

[32]HORN B W， GREENE R L， SORENSEN R B， et al. Conidial movement of nontoxigenicAspergillusflavusandA.parasiticusin peanut fields following application to soil[J].Mycopathologia， 2000， 151(2): 81-92.

[33]NTAHIMPERA N， WILSON L L， ELLIS M A， et al. Comparison of rain effects on splash dispersal of threeColletotrichumspecies infecting strawberry[J].Phytopathology， 1999， 89(7): 555-563.

[34]SAVAGE D， BARBETTI M J， MACLEOD W J， et al. Seasonal and diurnal patterns of spore release can significantly affect the proportion of spores expected to undergo long-distance dispersal[J].MicrobialEcology， 2012， 63(3): 578-585.

[35]TUCKER K， STOLZE J L， KENNEDY A H， et al. Biomechanics of conidial dispersal in the toxic moldStachybotryschartarum[J].FungalGeneticsandBiology， 2007， 44(7): 641-647.

[36]LI W， LEVY L， HARTUNG J S. Quantitative distribution of ‘CandidatusLiberibacterasiaticus’ in citrus plants with citrus huanglongbing[J].Phytopathology， 2009， 99(2): 139-144.

[37]TATINENI S，SAGARAM U S，GOWDA S，et al. In planta distribution of‘CandidatusLiberibacterasiaticus’as revealed by polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR[J].Phytopathology， 2008， 98(5): 592-599.

(責任編輯張韻)

Infection， spread and distribution of pathogens of twig blight disease on bayberry

REN Hai-ying1， LIANG Sen-miao1， ZHENG Xi-liang1， QI Xing-jiang1，*， ZHU Xiao-ting2， YAN Li-ju2

(1.InstituteofHorticulture，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.LinhaiSpecialtyTechnologyPromotionStationofZhejiangProvince，Linhai317000，China)

In order to develop the effective technologies to prevent and control the twig blight disease of bayberry， it was studied that how conidia infected and disseminated， how the twig blight disease occured and spread in the whole year， and how the fungi distributed in bayberry plants. The conidia solution with concentrations of 2×101to 2×106mL-1could infect bayberry mainly through the orifice and wound on the young shoots. The conidia had two peaks of infection， the whole May， the mid of June to the mid of July， respectively. The conidia could be captured throughout the year. There were 2 captured peaks， the mid of May to the mid of June， the end of August to the mid of October， respectively. The bayberry trees had new diseased shoots throughout the year， and the peak incidence was in the middle of September to the early of November. The twig blight disease had the centers， and the trees in the low altitude， water erosion serious position were infected firstly. The isolated fungal strains and DNA copy numbers of the diseased were 2-6 times of the healthy in a whole year. The pathogens could survive in the bayberry plants in the whole year with the most quantity in young shoots， but without obvious time peaks.

twig blight disease on bayberry;Pestalotiopsisversicolor；Pestalotiopsismicrospora；conidia

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.14

2015-11-23

浙江省重大科技專項重點農業項目資助(2012C12009-5) ；公益性行業(農業)科研專項資助(201203089)

任海英(1974—)，女，山東沂水人，博士，副研究員，從事果樹病理學研究。E-mail: renhy@mail.zaas.ac.cn

，戚行江，E-mail：qixj@mail.zaas.ac.cn

S667.6

A

1004-1524(2016)04-0630-10

任海英，梁森苗，鄭錫良，等. 楊梅凋萎病菌侵染、傳播及樹體內分布規律[J].浙江農業學報，2016，28(4)： 630-639.